Tải bản đầy đủ - 82 (trang)
6 Đo đạc các thông số

6 Đo đạc các thông số

Tải bản đầy đủ - 82trang

42



2.6.2 Phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier (FTIR)

Máy phân tích phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier (FTIR) là công cụ có khả

năng xác định các liên kết hóa học (các nhóm chức) (hình 2.9). Bước sóng ánh sáng

hấp thụ đặc trưng với liên kết hoá học được quan sát trên phổ. Liên kết phân tử dao

động tại các tần số khác nhau phụ thuộc vào nguyên tố hóa học và từng loại liên kết.

Với mỗi liên kết đều có một số tần số dao động đặc trưng. Theo cơ học lượng tử,

những tần số này tương ứng với trạng thái cơ bản (tần số thấp nhất) và các trạng thái

kích thích (tần số cao hơn). Quá trình tạo cho tần số dạo động của một phân tử tăng lên

nhằm kích thích liên kết bằng cách hấp thụ một năng lượng ánh sáng. Bất kỳ sự dịch

chuyển nào giữa hai trạng thái năng lượng ánh sáng (xác định bởi bước sóng) phải

bằng đúng sự khác nhau về năng kượng giữa hai trạng thái. Trong nghiên cứu này,

máy phân tích phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier FTIR Nicolet 6700 (Thermo

USA), Phòng thí Nghiệm Trọng điểm Quốc gia về nghiên cứu Hóa dầu, trường ĐH

Bách Khoa Hà Nội được sử dụng để xác định liên kết giữa bề mặt vi cảm biến, màng

polyme dẫn APTS và DNA đầu dò.



Hình 2.9. Máy phân tích phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier (FTIR Thermo Nicolet 6700)



2.6.3 Kỹ thuật phản ứng chuỗi tổng hợp polymerase (PCR)

Kỹ thuật PCR nhằm thu được một số lượng lớn bản sao của một trình tự xác

định của vi rút HSV, sản phẩm PCR có kết quả dương tính sẽ được sử dụng để thử

nghiệm như mẫu thực để xác định độ nhạy và khả năng phát hiện DNA bổ sung của



43



cảm biến sinh học chế tạo được. Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh phẩm là dịch não

tủy lấy bệnh nhân có ký hiệu VN055, được tách chiết với bộ QIAamp® DNA minikit,

QIAGEN; bộ Master Mix GoTaq® Green , Promega M712B. Mồi xuôi có trình tự: 5’–

AT CAC CGA CCC GGA GAG GGA C–3’, mồi ngược có trình tự : 5’-GG CCA

GGC GCT TGT TGG TGT A-3’. Kỹ thuật này được thực hiện với 35 chu kỳ trên máy

MiniCycler™. Sản phẩm PCR được giữ ở 4°C trước khi sử dụng. Quá trình làm mẫu

được thực hiện tại phòng thí nghiệm các vi rút Herpes – khoa Vi rút, Viện Vệ sinh

Dịch tễ Trung ương.



2.6.4 Xây dựng hệ đo tín hiệu cảm biến sinh học

Để kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu cũng như khả năng phát hiện các đoạn axit

nucleic đặc hiệu của vi rút HSV, chúng tôi sử dụng bộ khuyếch đại Lock-in SR830.

+ Bộ khuếch đại Lock-in SR830

Bộ khuếch đại Lock-in SR830 dùng để phát hiện và đo tín hiệu xoay chiều rất

nhỏ, với điện áp cỡ vài nano vôn. Phép đo được thực hiện chính xác ngay cả khi tín

hiệu nhỏ bị nhiễu bởi các nguồn nhiễu khác lớn hơn hàng nghìn lần.

Bộ khuếch đại sử dụng độ nhạy pha để phát hiện tín hiệu ra, đây là thành phần

đơn lẻ trong số các thành phần của tín hiệu tại tần số và pha chuẩn riêng biệt. Tín hiệu

nhiễu tại tần số khác với tần số chuẩn đặc trưng được loại bỏ và không ảnh hưởng đến

phép đo.

TÝn hiÖu chuÈn



Sig

TÝn hiÖu h×nh sin



TÝn hiÖu tõ Lock-in



Ref



Hình 2.10 Dạng sóng từ bộ khuếch đại Lock-in



44



Bộ khuếch đại SR830 phát ra sóng hình sin có dạng chuẩn lock-in (lock-in

reference) là: VLsin(ωLt + θref). Tín hiệu này sau đó được khuếch đại bởi bộ phát hiện

độ nhạy pha hoặc bộ nhân. Đầu ra của bộ phát hiện độ nhạy pha này là hai sóng hình

sin.

=



VsigVLsin(ωrt + θsig)sinωLt + θref)



=



Vpsd



1/2 VsigVLcos([ωr - ωL]t + θsig - θref)

-1/2 VsigVLcos([ωr + ωL]t + θsig + θref)



(2.7)



(2.8)



Đó là hai tín hiệu xoay chiều, có tần số tại (ωr - ωL) và (ωr + ωL). Nếu đầu ra

của bộ phát hiện độ nhạy pha được cho qua bộ lọc tần thấp, tín hiệu xoay chiều có tần

số cao được loại bỏ. Tuy nhiên, nếu ωr bằng ωL thì thành phần hiệu hai tần số sẽ là tín

hiệu một chiều. Trong trường hợp này, đầu ra của hệ phát hiện độ nhạy pha được đưa

qua bộ lọc sẽ là Vpsd = 1/2 VsigVLcos(θsig - θref). Đây là tín hiệu một chiều tỷ lệ với tín

hiệu khuếch đại.

+ Phương pháp đo

Khi có sự lai hoá giữa các chuỗi DNA đích với DNA đầu dò được cố định trên

bề mặt vi cảm biến sẽ tạo sự thay đổi mật độ điện tích trên bề mặt màng polymer dẫn.

Lúc này, vùng điện cực chỉ phủ APTS sẽ đóng vai trò là điện cực so sánh, còn điện

cực phủ APTS gắn DNA đóng vai trò là điện cực hoạt động sẽ có giá trị chênh lệch về

độ dẫn so với điện cực so sánh này. Từ đó, ta xác định được sự phụ thuộc giữa nồng

độ của DNA và sự chênh lệch về độ dẫn giữa hai vùngg vi điện cực.

Sự chênh lệch độ dẫn giữa hai vùng vi điện cực này được đưa vào máy Lockin SR830 để xử lý (lọc nhiễu, so sánh, khuếch đại) và hiển thị ra kết quả dưới dạng

điện áp.

+) Cách bố trí hệ đo

Quá trình đo này sẽ được mô tả ngắn gọn như sau: Tín hiệu chuẩn của dòng

xoay chiều có tần số 10 KHz và biên độ 100 mV được lấy từ bộ khuếch đại Lock-in

SR830, kích thích lên hai vi điện cực. Tín hiệu ra lúc này được đặt trên hai điện trở

1KΩ bởi hai kênh A và B của bộ khếch đại (hình 2.10).



45



Vin



A



~



Vout







B



R

(1K)



R

(1K)



Điện cực

so sánh

Điện cực

hoạt động



Mẫu phân

tích



Hình 2.11. Hệ đo vi sai sử dụng máy khuyếch đại Lock-in SR830



+) Nguyên lý đo

Từ cách bố trí hệ đo như trên, ta có thể vẽ được mạch tương đương của hệ đo vi

sai như hình 2.11.



Hình 2.12. Mạch tương đương của hệ đo vi sai



Với:

S: Tín hiệu so sánh từ bộ phát với điện áp V = 100mV.

Rout: Điện trở ngoài, Rout = 1KΩ.

R: Điện trở của màng polyme dẫn.

G: Vôn kế (Điện áp ra (Vout) được hiển thị).



46



Khi đó dòng điện của hệ đo được xác định bởi công thức dưới đây:

V

R + Rout



I=



(2.9)



Mặt khác:

I=



Vout

Rout



(2.10)



V + Vout

Rout

Vout



(2.11)



Từ (2.9) và (2.10) ta có:

R=



Độ dẫn được tính theo công thức:

1

R



G=



(2.12)



Từ (2.11), (2.12) độ dẫn của màng polyme dẫn có dạng:

Vout

1

=

R (V + Vout )Rout



G=



(2.13)



Do, V >> Vout (V = 100 mV, Vout ~ mV ), khi đó ta có:

G=



Vout

V .Rout



(2.14)



G=



Vout

V

= out ( S )

−3

100

10 x10



(2.15)



Hay:



Hoặc:



ΔG =



−1



ΔVout

(S )

100



(2.16)



Như vậy, ở đây tần số không được đo bởi nó tác động trực tiếp đến màng

polyme dẫn và được biểu diễn bởi giá trị điện áp ra (Vout).

+ Thực hiện các phép đo

Pha loãng mẫu phân tích chứa DNA bổ sung có trình tự 5’-G TCC CTC TCC

GGG TCG GTG AT-3’ trong nước có enzyme bảo vệ axit nucleic tới nồng độ nM.

Sau khi đã nối vi cảm biến với đầu vào của bộ khuếch đại Lock-in. Các phép đo

được thực hiện như sau :



47



-



Nhúng vi cảm biến đã cố định DNA đầu dò vào trong cốc thuỷ tinh chứa 1ml

nước khử ion đặt trong hệ gia nhiệt có thể thay đổi nhiệt độ.



-



Mẫu phân tích có nồng độ khác nhau được nhỏ vào trong cốc tuỳ theo phép đo

nhằm xác định khả năng bắt cặp của DNA đầu dò và DNA đích trên bề mặt vi

cảm biến theo nồng độ, thời gian và nhiệt độ. Tín hiệu được thể hiện bằng sự

chênh lệch thế đầu ra giữa điện cực so sánh và điện cực hoạt động.

Đối với sản phẩm PCR của HSV cũng được pha loãng tới nồng độ nM. Sau đó



nâng nhiệt độ lên 95°C trong khoảng 5 phút để tách hoàn DNA sợi đôi của HSV thành

các sợi đơn, rồi hạ nhanh nhiệt độ xuống khoảng 50 – 55°C và thực hiện đo đạc với vi

cảm biến, quá trình này nhằm tạo ra sự lai hóa thành các DNA sợi đôi trên bề mặt cảm

biến. Đo tín hiệu theo thời gian trên bộ Lock in SR830. Tất cả các phép đo đều được

thực hiện trong tuýp nhựa (hoặc cốc thủy tinh) chứa 1ml nước khử ion. Những mẫu

còn lại được cất giữa ở 4°C chờ thực hiện các phép đo tiếp theo.

Để khẳng định độ nhạy và tính đặc hiệu của vi cảm biến sinh học DNA trong

việc phát hiện axit nucleic của vi rút HSV, vi cảm biến cũng được đo đạc với mẫu

phân tích chỉ có nước khử ion.

Các bước đo có thể khái quát theo hàm 2.15:

Vout = f (C , T , t )



(2.15)



Trong đó C là nồng độ chất phân tích, T là nhiệt độ đo và t là thời gian ghi nhận

sự lai hóa, Vout là tín hiệu thế đầu ra tương ứng.

+ Xây dựng bảng mẫu để thực hiện và tổng hợp các kết quả các phép đo

Để thuận tiện cho quá trình đo đạc và kiểm tra các thông số của vi cảm biến

DNA, tác giả đã xây dựng bảng mẫu chuẩn để ghi nhận tín hiệu thế đầu ra tương ứng

với sự thay đổi của nồng độ chất phân tích, nhiệt độ và thời gian.



48

Bảng 2.4. Bảng mẫu thực hiện các phép đo theo nồng độ, nhiệt độ, thời gian



C1 [nM]



Cđích ; t



Cx[nM]



………



t1

[phút]







tq



t1



….



tq



t1







tq



T1



V111







V11q















Vx11



….



Vx1q



…..



….







….



….



….







….



….



….



Tp



V1p1



...



V1pq



….



….







Vxp1



….



Vxpq



V;T



Vout

[mV]



Trong bảng 2.4, Cx là nồng độ mẫu phân tích có thể pha loãng cỡ nM và thay

đổi từ nồng độ nhỏ nhất (C1 = Cmin) để thấy tín hiệu lai hóa đến xấp xỉ nồng độ DNA

đầu dò (Cđầu dò) (do sự mất mát DNA đầu dò trong quá trình cố định lên bề mặt vi cảm

biến nên chỉ đo nồng độ mẫu phân tích xấp xỉ nồng độ DNA đầu dò). Nhiệt độ phản

ứng Tp thay đổi từ nhiệt độ phòng T1 = Tphòng đến giá trị lớn hơn nhiệt độ biến tính Tm

(tín hiệu lai hóa sụt giảm). Trong quá trình đo đạc, việc nâng nhiệt độ nên quá Tm là

cần thiết để xác định được giá trị nhiệt độ biến tính giữa DNA đầu dò và DNA đích

bằng thực nghiệm. Ứng với mỗi nồng độ chất phân tích, các giá trị chênh lệch thế ở

đầu ra (Vout) được ghi lại theo thời gian t [phút], tính từ thời gian đáp ứng tương ứng

với quá trình xuất hiện sự lai hóa đến thời điểm tín hiệu đầu ra đạt giá trị ổn định

(tương ứng với sự lai hóa bão hòa).



49



CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Trong chương 2, quá trình thực nghiệm đã được mô tả chi tiết, tương ứng với

quá trình này, tác giả sẽ trình bày kết quả đạt được và bàn luận xung quanh những kết

quả đó.

3.1 Cảm biến vi điện cực

Trong giai đoạn đầu thực hiện đề tài, trên cơ sở thiết kế cảm biến vi điện cực

trước đây của nhóm nghiên cứu về cảm biến sinh học tại ITIMS, tác giả cùng nhóm

nghiên cứu đã chế tạo bộ cảm biến vi điện cực 30µm x 70µm để áp dụng cho mục đích

của đề tài. Hình 3.1A là hình ảnh của một cảm biến vi điện cực, có chiều dài 26mm,

chiều rộng 6mm, bao gồm hai vùng điện cực, trong đó một trong hai vùng sẽ đóng vai

trò là điện cực hoạt động, vùng còn lại đóng vai trò như điện cực so sánh. Hình 3.1B là

hình ảnh chụp dưới hiển vi điện tử quét phóng đại một vùng điện cực Pt có cấu trúc

kiểu răng lược đan xen nhau. Độ rộng của mỗi bản điện cực là 70µm, khoảng cách

giữa hai điện cực liên tiếp là 30µm. Diện tích vùng điện cực hoạt động là 1,4mm x

1,1mm.

B



A



Hình 3.1A. Vi cảm biến 30µm x 70µm sau Hình 3.1B. Vùng điện cực hoạt động của vi

khi đã cắt ra từ phiến silic với hai vùng cảm biến 30µm x 70µm chụp dưới kính hiển

điện cực được thiết kế song song



vi điện tử quét



Với loại cảm biến 30µm x 70µm, thể tích mẫu phân tích phải đủ lớn để nhúng

ngập hai vùng điện cực hoạt động và so sánh, hệ đo cồng kềnh hơn và tín hiệu đầu ra ít

ổn định hơn so với loại vi cảm biến thế hệ mới. Mặt khác, do nồng độ mẫu phân tích

thường rất thấp nên phải pha loãng mẫu gấp nhiều lần. Khoảng cách giữa hai vi điện

cực kế nhau là 30µm dẫn đến sự trao đổi của những ion mang điện giữa các vi điện



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

6 Đo đạc các thông số

Tải bản đầy đủ ngay(82 tr)

×