Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

Luận văn Thạc sĩ 2013

hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4); thuốc thử vanilin­H2SO4 (vanillin 1,2g; MeOH 

200ml, CH3COOH 25ml; H2SO4 11ml)

Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của 

viện

Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker Avance 

500MHz viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

Các dung mơi như n­hexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol

 đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.

2.1.4 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính gây độc tế bào

Mơi trường ni cấy tế  bào: AMEM và AMEM có bổ  sung 1% insulin,  

trypsin­EDTA (Gibco, Hoa kỳ)

Dung mơi để hòa tan chất cần thử hoạt tính: DMSO

Tủ   ấm CO2  (Innova CO­170); Tủ  cấy vơ trùng cấp I ( Labcaire), cấp II  

(SterilGard II); 

Máy li tâm (universal 320 R); Kính hiển vi ngược (Axiovert 40 CFL)

Tủ lạnh sâu ­25oC, ­ 800C

 



Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ)



 



Máy quang phổ (GENios Tecan)

Bình nit ơ  l ỏ ng b ả o qu ả n t ế  bào và các d ụ ng c ụ  thí nghi ệ m thơng  



th ườ ng khác.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp hóa học

2.2.1.1 Phương pháp chiết dịch etylaxetat tổng

Dựa vào ngun lý chiết và tài liệu tham khảo  chúng tơi thực hiện ngâm 

chiết với dung mơi có độ  phân cực tăng dần. Thực hiện ngâm chiết   mẫu lần 



24



Luận văn Thạc sĩ 2013

lượt với các dung mơi etylaxetat và MeOH ở nhiệt độ thường. Mỗi loại dung mơi 

tiến hành ngâm chiết 3 lần, mỗi lần trong vòng 24h.

2.2.1.2. Sắc ký cột (Colum chromatography ­  CC)



Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất 

dựa vào độ  phân cực của chúng hoặc tùy theo kích thước phân tử. Trong  

nghiên cứu này, việc phân lập các chất được thực hiện bằng sắc ký cột với  

chất mang là silica gel (hệ dung mơi rửa giải với độ phân cực tăng dần) hoặc  

gel LH­20.

 Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel Merck loại 40 ­  

63 m  với dung mơi rửa giải thích hợp.

2.2.1.3 Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer Chromatography – TLC)

S¾c ký lớp mỏng là phương pháp nghiên cứu hiệu quả để phân tích và xác 

định số lượng các nhóm chất khác nhau có trong thành phần dịch chiết thực vật 

hoặc các phân đoạn tách ra từ đó. Dựa trên ngun tắc các chất khác nhau có độ 

dịch chuyển khác nhau nên tách ra  ở  vị  trí khác nhau. Đây là phương pháp vi  

lượng, hiệu quả tách cao và thời gian thực hiện ngắn.

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel Merck 60 F254, 

dày 0,25 mm. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng (λ =  254 nm và 

λ = 366 nm ) và dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2.

Đối với sắc ký bản mỏng, việc lựa chọn dung mơi hay hệ  dung mơi cho 

độ phân tách tốt là quan trọng nhất. Cụ thể với các u cầu khảo sát thì chọn hệ 

dung mơi sao cho các vệt phân tách nhau tốt nhất.

2.2.1.4 Phổ khối lượng (Mass spectrometry ­ MS)

Khối phổ  là một trong các phương pháp được sử  dụng để  xác định khối  

lượng phân tử  của chất nghiên cứu dựa vào sự  phát triển ra ion phân tử, từ  đó 

giúp xây dựng cơng thức phân tử.



25



Luận văn Thạc sĩ 2013

Phổ khối lượng phun mù điện tử ( Electron Spray Ionization Mass Spectra)  

được đo bằng phương pháp ESI trên máy Agilent 1120 tại Viện Hóa học, Viện  

Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

2.2.1.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (Nuclear 

magnetic resonance spectrometry ­ NMR)

Phổ  NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các  

hợp chất hóa học, dựa trên ngun tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các 

ngun tử khi được đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thơng số có 

đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa 

học δ và hằng số tương tác spin – spin  J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và  

2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo.

Phổ  cộng hưởng từ  hạt nhân được đo trên máy Bruker AM 500 FT­

NMR Spectrometer, Viện Hóa học ­ Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt 

Nam

với TMS là chất chuẩn nội.

2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa  

kỳ

 (NCI) xác nhận là phép thử  độ  độc tế  bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các 

chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in 

vitro.

Các dòng tế  bào ung thư  nghiên cứu được ni cấy trong các mơi trường 

ni cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh bê (FBS) và các thành phần  

cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO 2, 37 oC, độ ẩm 98%, vơ trùng tuyệt 

đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế  bào khác nhau, thời gian cấy 

chuyển cũng khác nhau. Tế  bào phát triển  ở  pha log sẽ  được sử  dụng để  thử 

hoạt độc tính. Mẫu thơ có IC50   50  g/ml; chất sạch có IC50   30  g/ml  được 



26



Luận văn Thạc sĩ 2013

đánh giá là có hoạt tính gây độc tế  bào, có khả  năng  ức chế  sự  phát triển hoặc  

diệt tế bào ung thư.

Thử độc tế bào:

­ Mẫu thử   được pha loãng theo dãy nồng  độ  là 128   g/ml; 32 g/ml; 8 g/ml; 

2 g/ml; 0,5 g/ml. Bổ  xung 200 l dung dịch tế bào ở  pha log nồng độ  3 x 104 tế 

bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng. Giếng điều khiển có 200  l dung dịch tế bào 

3x104 tế bào/ml. Ủ ở 370C/ 5% CO2 trong 72h.

­ Sau 72h thêm 50  l MTT (1mg/ml pha trong mơi trường ni cấy khơng huyết 

thanh) và  ủ  tiếp  ở  370C/4 giờ; loại bỏ  mơi trường, thêm 100  l DMSO lắc đều 

đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.

GI: Phần trăm kìm hãm sự phát triển

Giá trị  IC50 được tính dựa trên kết quả  số liệu phần trăm kìm hãm sự  phát triển  

của 

tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.

Thí nghiệm được lặp lại với n = 3

2.3 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Cơm 

2.3.1 Thành phần hóa học

2.3.1.1 Phân lập cặn chiết etylaxetat

Vỏ  cây được thu hái, phơi khơ trong bóng mát, sấy khơ  ở  40­50oC cho đến 

khi độ   ẩm đạt  ≤ 13% và nghiền nhỏ  cân được 1,44 kg. Ngun liệu này được  

ngâm chiết lần lượt với etylaxetat (3 lần, mỗi lần 24 giờ), sau đó là MeOH (3  

lần, mỗi lần

 24 giờ), thu được các dịch chiết tương ứng là etylaxetat và MeOH. Các dịch 

chiết này được cất loại dung mơi dưới áp suất thấp, kết quả  thu được 52g cặn 

chiết etylaxetat và 172,8 g cặn chiết MeOH. Trong khn khổ luận văn chúng tơi 

chỉ   tập   trung   nghiên   cứu   phần   cặn   chiết   EtOAC.   Quy   trình   tách   chiết   dịch 

etylaxetat được trình bày theo sơ đồ sau:



27



Luận văn Thạc sĩ 2013



Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tách chiết dịch etylaxetat từ vỏ cây Cơm

2.3.1.2 Phân lập các chất có trong cặn chiết etylaxetat

Cặn chiết etylaxetat được phân tách bằng sắc ký cột trên cột silica gel, hệ 

dung mơi rửa giải là CH2Cl2/MeOH với tỷ  lệ  MeOH tăng dần từ  0 ­ 30 %, thu 

được 5 phân đoạn được ký hiệu từ  E1 – E5. Phân đoạn E1 được phân tách trên 

cột silica gel với hệ dung mơi n­hexan/CH2Cl2 gradient với  tỷ lệ CH2Cl2  tăng dần 

từ  50­ 70% thu được 24 phân đoạn ký hiệu là E1.1­E1.24. Phân đoạn E1.7 được  

tinh chế  trên cột silica gel với hệ  dung mơi n­hexan/CH2Cl2   gradient với   tỷ  lệ 

CH2Cl2    tăng dần từ  2­ 40% thu được 2 phân đoạn ký hiệu là E1.7.1 và E1.7.2. 

Phân đoạn E1.7.1 tiếp tục được tinh chế  trên cột silica gel với hệ  dung môi n­

hexan/CH2Cl2  gradient (95:5) và giải hấp cột với hệ  dung môi CH2Cl2  / MeOH 

gradient cho hợp chất F1 (12 mg). Phân đoạn E1.12 được kết tinh lại trong hệ n­

Hexan:diclometan (3:7) thu được 103 mg tinh thể hình kim, màu trắng. Hợp chất  

này được nhận dạng là β­sitosterol dựa vào việc so sánh điểm nóng chảy và sắc 

ký   lớp   mỏng   (TLC)   với   hợp   chất  β­sitosterol   chuẩn   có   sẵn   trong   phòng   thí 

nghiệm. 

Phân đoạn E2 xuất hiện chất rắn màu trắng, chất rắn được lọc và rửa lại 

nhiều lần với hệ CH2Cl2/MeOH, thu được 45 mg hợp chất  F2. Ngồi ra, dịch lọc 

được quay khơ rồi tinh chế  trên cột silica gel với dung mơi rửa giải là CH 2Cl2 / 

MeOH gradient thu được 30 mg chất bột màu trắng. Hợp chất này được nhận  

dạng là  β­sitosterol glucoside  dựa vào việc so sánh nóng chảy và sắc ký lớp  

mỏng (TLC) với hợp chất  β­sitosterol glucoside chuẩn có sẵn trong phòng thí 

nghiệm.

Phân đoạn E5 được phân tách trên cột silica gel với hệ dung mơi CH2Cl2/ 

MeOH/HCOOH (80:15:5) gradient thu được 11 phân đoạn ký hiệu là E5.1­E5.11. 

Tinh thể  của   phân đoạn E5.4 được tinh chế  trên cột sephadex LH 20 cho hợp  



28



Luận văn Thạc sĩ 2013

chất F3 (7 mg). Tinh thể của phân đoạn E5.9 tiếp tục được tinh chế lại trên cột 

sephadex LH­20 thu được hợp chất F4 (5 mg).

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất của dịch EtoAc từ vỏ cây Cơm

2.3.2  Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập được từ dịch 

chiết etylaxetat

Các chất đã tinh sạch được tiến hành thử  hoạt tính theo các phương pháp 

đã nêu trong phần 2.2.2

Cân 3mg chất cần thử, hòa tan bằng DMSO (150μl) có giếng chất nồng độ

đầu là 20mg/ml. Tiến hành pha lỗng tiếp theo tỉ lệ ¼ để được các nồng độ chất 

thử

tiếp theo. Chất sau khi hòa tan trong DMSO được pha lỗng về các nồng độ thấp 

hơn bằng nước cất cho các nồng  độ  lần lượt là 2,56 mg/ml; 0,64 mg/ml;0,16 

mg/ml;

0,04 mg/ml; 0,01 mg/ml. Sử dụng 10 μl chất thử đã pha lỗng cho mỗi giếng thử

nghiệm để được các nồng độ 128  g/ml; 32 g/ml; 8 g/ml; 2 g/ml; 0,5 g/ml.

Tiến hành thử theo các phương pháp đã nêu.



29



Luận văn Thạc sĩ 2013



CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trong khn khổ  dự  án Pháp – Việt về  “Nghiên cứu hóa thực vật thảm  

thực vật Việt Nam”, cây Cơm đã được thử sơ bộ hoạt tính sinh học. Kết quả cho  

thấy dịch chiết etylaxetat của vỏ cây Cơm thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên  

dòng tế bào KB (ức chế  89,45 %  ở nồng độ 1 µg/ml). Chính vì vậy vỏ cây Cơm 

được tiến hành tách chiết và phân lập các chất theo các phương pháp đã trình bày  

ở mục 2.3.1.1 và mục 2.3.1.2

3.1 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch chiết 

etylaxetat

Từ cặn chiết EtoAc chúng tơi tiến hành phân lập các hoạt chất theo sơ đồ 

2.2. Kết quả thu được 4 chất sạch kí hiệu là F1­F4. Các chất này được xác định 

cấu trúc hóa học bằng cách kết hợp các phương pháp phổ và so sánh số liệu phổ 

của chúng với các dữ liệu phổ đã được cơng bố.

3.1.1 Chất F1 (pentacosyl ferulate)

Trên phổ EI­MS của F1 cho thấy sự xuất hiện của pic ion phân tử [M]+ tại 

m/z 544. Trên phổ  1H­NMR thấy xuất hiện tín hiệu của nhóm methyl  ở  trường 

cao δH  0,88 (t,  J = 7 Hz, CH3­25’) và một nhóm methoxy (OCH3)  ở  δH 3,915. Ở 

vùng trường thấp thấy xuất hiện tín hiệu của 3 proton đặc trưng cho vòng thơm  

bị thế hệ ABX,  ở  δH 6,86 (d, J = 8 Hz, H­5), 7,05 (dd, J = 2 Hz và 8 Hz, H­6) và 

7,08 (d, J = 2 Hz, H­2). Ngồi ra còn có tín hiệu của 2 proton alken có cấu hình  

trans (E) ở δH 6,39 (d, J = 16 Hz, H­8) và 7,61 (d, J = 16 Hz, H­7). Ngồi ra còn có 



30



Luận văn Thạc sĩ 2013

tín hiệu của 24 nhóm methylen, trong đó nhóm methylen có tín hiệu proton  ở   δH 

4,10 (t, J = 6,5 Hz, CH2­1’) cho thấy nhóm này liên kết với dị tố oxy.

Trên phổ  13C NMR và DEPT của F1, ngồi các tín hiệu tương ứng với các 

nhóm đã  được  quan sát trên phổ  1H NMR, còn xuất hiện tín hiệu của  nhóm 

cacbonyl cacboxylate tại δC 167,8 và 3 cacbon thơm bão hòa  ở   δC 126,1, 147,4 và 

148,5.   Các   cacbon   ở   δC  147,4   và   148,5   cho   th ấy   chúng   đượ c   liên   kết   với  

ngun tử oxy.

Kết hợp pic ion phân tử trên phổ khối lượng với các tín hiệu 1D NMR,

cơng thức phân tử  của chất F1 đượ c xác định là C 35H60O4. Phân tich phổ  2D 

NMR   cho   thấy   sự   có   mặt   của   2   mảng   cấu   trúc   của   hợp   chất   F1:   A)   axit  

ferulic, B)  pentacosan­1­ol. Vi ệc k ết n ối gi ữa 2 ph ần c ấu trúc này đượ c thực 

hiện nhờ  phân tích phổ  HMBC. Trong đó tươ ng tác giữa cacbon cacboxylate  ở 

với proton của nhóm CH2­1’  ở  đượ c quan sát thấy trên phổ  HMBC của F1.  

Điều này cho thấy hợp chất F1 là ester của axit ferulic và pentacosan­1­ol. Như 

vậy hợp chất F1 đượ c xác định là pentacosyl ferulate.  H ợp ch ất này đã đượ c 

phân lập trước đây từ lồi Bauhainia manca.



Hình 13: Cấu trúc hóa học của hợp chất F1

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H­NMR (500 MHz) và 13C­NMR (125 MHz) của chất 

F1 trong DMSO

Cno



δC



1

2

3

4

5



126,1

109,92

147,4

148,5

114,9



31



δ H m 

(J, đơn vị Hz)

7,08 d (2,0)



6,863 d (8,0)



Cno



δC



7

8

9

1’

2’­24’



144,96

114,4

167,8

64,37

28,32



δ H m 

(J, đơn vị Hz)

7,61 d (16)

6,39 d (16)

4,10 t (6,5)

1,71 s (7,0; 7,5)



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×