Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
TS. NGUYỄN MINH XUÂN HỒNG

TS. NGUYỄN MINH XUÂN HỒNG

Tải bản đầy đủ - 0trang

MỤC LỤC

MỤC LỤC..............................................................................................................................................................1

DANH SÁCH BẢNG............................................................................................................................................2

DANH SÁCH HÌNH.............................................................................................................................................3

Chương 1 Mở đầu.................................................................................................................................................4

1.1.



Đặt vấn đề...............................................................................................................................................4



1.2.



Mục tiêu..................................................................................................................................................5



Chương 2 Tổng quan............................................................................................................................................5

2.1. Khái quát về Salmonella..............................................................................................................................5

2.2 Kỹ thuật PCR...............................................................................................................................................7

Chương 3 Vật liệu và phương pháp....................................................................................................................9

3.2.1. Phương pháp thực hiện.............................................................................................................................9

3.2.1. Tiền tăng sinh mẫu.............................................................................................................................9

3.2.2. Qui trình tách chiết DNA..................................................................................................................9

3.2.3. Thực hiện phản ứng PCR...................................................................................................................12

3.2.4. Điện di kiểm tra kết quả PCR.............................................................................................................13

3.2.2. Đọc kết quả............................................................................................................................................16

Chương 4 Kết luận.........................................................................................................................................17



1



DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR...................................................................................................................12

Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt của các phản ứng PCR....................................................................................................12



2



DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1: Dung dịch tiện tăng sinh........................................................................................................................9

Hình 3.2: Loại bỏ xác mẫu trong dung dịch tiện tăng sinh...................................................................................9

Hình 3.3: Thu kết tủa............................................................................................................................................10

Hình 3.4: Thu kết tủa lần 2...................................................................................................................................10

Hình 3.5: Làm lạnh dung dịch.............................................................................................................................11

Hình 3.6: Phản ứng PCR......................................................................................................................................11

Hình 3.7: Các bước chuẩn bị gel agarose 1%......................................................................................................14

Hình 3.8:Các bước thực hiện điện di trên gel agarose........................................................................................14

Hình 3.9: Chọn hiệu điện thế điện di...................................................................................................................14

Hình 3.10. Xem kết quả chạy điện di..................................................................................................................15

Hình 3.11. Xem kết quả chạy điện di dưới đèn UV............................................................................................15



3



Chương 1

Mở đầu

1. Đặt vấn đề

Cuộc sống ngày càng phát triển, nhiều thiết bị hiện đại được phát minh giúp cho

ngành công nghệ thực phẩm phát triển, đáp ứng được nhu cầu của con người về thực phẩm..

Bên cạnh đó, các phương pháp chế biến thực phẩm cũng được cải tiến hơn, nhiều phương

pháp nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm đã được đưa ra, giúp rút ngắn thời gian chế biến,

tăng cấu trúc, màu sắc và hương vị của sản phẩm.

Tuy nhiên, vấn đề được quan tâm nhất trong ngành thực phẩm đó là vấn đề vệ sinh

an toàn thực phẩm. Một trong những lồi vi sinh vật có khả năng gây ngộ độc cao và được

quan tâm nhiều nhất đó là Salmonella. Salmonella là tên chung của nhiều loại vi khuẩn.

Chúng có thể có mặt ở các loại thịt gia cầm và trứng, hay ở cả trái cây và rau nữa. Hầu hết

các loại Salmonella đều tác hại trực tiếp vào bao tử khiến người bệnh đau bụng, tiêu chảy

và nôn mửa trong vài ngày. Cũng có loại vào đường ruột, gây thương hàn khiến người bệnh

có thể tử vong. Do đó, việc phát hiện Salmonella có trong thực phẩm được đặt lên hàng đầu.

Phương pháp hiện đại gần đây được sử dụng nhiều là PCR (Polymerase Chain Reaction) là

một phương pháp khuếch đại DNA chuyên biệt bằng cách sử dụng mồi chuyên biệt. Trong

bài báo cáo này, nhóm xin trình bày phương pháp PCR được sử dụng để phát hiện

Salmonella trong thực phẩm.

2. Mục tiêu

-



Tiếp cận phương pháp PCR



-



Sử dụng phương pháp PCR phát hiện Salmonella trong mẫu vật.



4



Chương 2

Tổng quan

2.1. Khái quát về Salmonella

Salmonella



được



xếp



vào



giới



Bacteria,



ngành



Proteobacteria,



họ



Enterobacteriaceae, chi Salmonella. Giống Salmonella hiện nay được chia thành 2 lồi:

Salmonella bongori (khơng gây bệnh) và Salmonella enterica (gây bệnh). Ðến nay, hơn

2.500 kiểu huyết thanh thuộc chi Salmonella.

S. enterica lại được chia ra làm 6 dưới loài khác nhau là S. enterica (S. enterica I), S.

salamae (S. enterica II), S. arizonae (S. enterica IIIa), S. diarizonae (S. enterica IIIb), S.

houtenae (S. enterica IV) và S. indica (S. enterica VI). Phần lớn, các serotype thuộc S.

enterica I là nguyên nhân gây hơn 99,9 % các bệnh nhiễm trùng ở người và động vật.

Trong đó, một số lồi Salmonella có tầm quan trọng trong chẩn đốn bệnh ở ngườivà động

vật là:

-



S. typhi: chỉ gây bệnh cho người. Ở Việt Nam, bệnh thương hàn chủ yếu do vi khuẩn

này gây ra.



-



S. paratyphy A: chỉ gây bệnh thương hàn cho người. Ở Việt Nam, thường phát hiệnvi

khuẩn này sau vi khuẩnS. typhi.



-



S. paratyphy B: gây bện thương hàn chủ yếu cho người, đơi khi có ở súc vật, thương

phát hiệnở các nước châu Âu.



-



S. paratyphy C: vừa có khả năng gây bệnh thương hàn vừa có khả năng gây bệnh

viêm dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết, thường xuất hiệnở các nước Đông Nam Á.



-



S. typhimurium và S. enteritidis gây bệnh cho người và gia súc, là nguyên nhân chủ

yếu của nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn do vi khuẩn Salmonella.



-



S. choleraesuis: là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm trùng huyết do vi

khuẩn



5



Về hình thái, Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hình que, ngắn, hai đầu hơi tròn,

kích thước trung bình khoảng 0,4 – 0,6 x 1 – 3 µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S.

gallimarum và S. pullorum, có khoảng 7 đến 12 tiên mao bao quanh thân; phát triển tốt ở

nhiệt độ 6 °C- 42 °C, thích hợp nhất ở 37 °C, pH thích hợp là 6,8 – 7,2.

Đặc điểm nuôi cấy Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển được trên các

mơi trường nuôi cấy thông thường, làmđục môi trường canh thang sau 18 h. Trên mơi

trường thạch thường, khuẩn lạc Salmonella tròn, lồi, trắng xám, trong, bờ đều, đường kính

khoảng1 – 1,5 mm. Salmonella có thể mọc trên những mơi trường có chất ức chế chọn lọc

như HE (hektoen entericagar), XLD (xylose lysine deoxycholate). Trên mơi trường HE,

khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay khơng có tâm

đen, một số dòngSalmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.Còn

trên mơi trường XLD, khẩn lạc đặc trưng của Salmonella có màu hồng trong suốt,có hay

khơng cótâm đen, một số dòng Salmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết

khuẩn lạc, môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu đỏ.

Đặc điểm sinh hóa. Phần lớn, các chủng Salmonella không lên men lactose, lên men

glucose và sinh hơi. Phản ứng oxidase âm tính, indol âm tính, VP âm tính, ure âm tính,

H2S dương tính.

2.2 Kỹ thuật PCR

PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp được sử dụng trong sinh học phân tử

để khuếch đại một hay một vài bản sao của đoạn DNA bất kì của sinh vật, tạo thành hàng

triệu bảo sao từ một trình tự đặc trưng ban đầu. Phương pháp này được áp dụng phổ biến

để khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu và rất hữu ích trong chẩn đoán và theo dõi các bệnh

di truyền, định danh sinh vật và nghiên cứu chức năng gen.

Phản ứng PCR gồm các thành phần: DNA khuôn, mồi xuôi và mồi ngược, các nucleodite

(dNTP), enzyme DNA polymerase, MgCl2 và dung dịch đệm.

Thơng qua các chu kì ln nhiệt, các đoạn DNA mục tiêu được tổng hợp nhờ enzyme

6



DNA polymerase.



Hình 2.1 Thành phần và một chu kì nhiệt của phản ứng PCR.



7



Chương 3

Vật liệu và phương pháp

3.1. Dụng cụ và thiết bị

3.1.1. Dụng cụ

Pipet 200-



Kéo



1000 µL



Bao tay



Pipet 20- 200 µL



Đầu hút pipet 200-1000 µL



Pipet 2.0- 20 µL



Đầu hút pipet 20- 200 µL



Pipet 1.0-10 µL

3.1.2. Thiết bị

Cân phân tích



Máy Vortex



Tủ hút



Máy PCR



Máy ly tâm tốc độ 6000 vòng,



Lò vi sóng



>11.000 vòng



Water bath (1000C)



Bộ điện di ngang

3.2. Phương pháp thực hiện

3.2.1. Tiền tăng sinh mẫu

Cân 25 g mẫu cho vào túi nylon vô trùng, bổ sung 100 mL môi trường BPW vào

túi. Ủ mẫu đã chuẩn bị trên ở 37 + 1 oC trong 18 ( + 2) giờ

3.2.2. Qui trình tách chiết DNA

 Lấy 2 mL dịch tiền tăng sinh mẫu vào ống eppendorf.



8



Hình 3.1: Dung dịch tiện tăng sinh

 Ly tâm 6000 vòng/10 giây để loại bớt xác mẫu, thu dịch nổi để ly trích DNA.



Hình 3.2: Loại bỏ xác mẫu trong dung dịch tiện tăng sinh

 Ly tâm 11.000 vòng/10 phút, đổ bỏ dịch nổi và thu kết tủa (sinh khối tế bào)



9



Hình 3.3: Thu kết tủa



 Huyền phù tủa trong 1 mL dung dịch PBS hoặc nước cất vô trùng.

 Ly tâm 11.000 vòng trong 10 phút, sau đó bỏ dịch nổi và thu phần tủa.



Hình 3.4: Thu kết tủa lần 2



 Huyền phù tủa trong 200 µL dung dịch đệm TE bằng cách vortex trong 10 giây.

 Đun các ống mẫu ở 100 oC trong 15 phút.

1

0



 Làm lạnh nhanh các ống này bằng cách đặt ống trong đá 15 phút.



Hình 3.5: Làm lạnh dung dịch

 Vortex trong 10 giây. Ly tâm ở 11000 vòng trong 10 phút ở 4 oC.

 Thu 50 – 100 µL phần dung dịch trên sang một tube mới.

 Tiến hành thực hiện phản ứng PCR hoặc bảo quản DNA ly trích ở -20 oC.



3.2.3. Thực hiện phản ứng PCR



Hình 3.6: Phản ứng PCR

Chuẩn bị phản ứng PCR với các thành phần như bảng 2.1.

1

1



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

TS. NGUYỄN MINH XUÂN HỒNG

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×