Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Bước 2: Mẫu thí nghiệm

Bước 2: Mẫu thí nghiệm

Tải bản đầy đủ - 0trang

x =

Trong đó:

x: là lượng protein trong mẫu (mg)

y: là OD595 đo được của mẫu.

3.3.8 Phương pháp xác định đặc tính của enzyme β- galactosidase

3.3.8.1 Xác định nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt của enzyme β- galactosidase

Xác định nhiệt độ tối thích của enzyme β- galactosidase như trình bày ở 3.3.3.

ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau (20, 30 0C, 370C, 400C, 500C, 550C, 600C, 650C,

700C, 750C, 800C). Các điều kiện thí nghiệm và thời gian thí nghiệm như phần 3.3.3.

chỉ khác nhau về nhiệt độ phản ứng.

Sau khi xác định được nhiệt độ tối ưu cho phản ứng thủy phân, chúng tôi tiến

hành xác định độ bền nhiệt của enzyme tại nhiệt độ tối ưu và 60 0C, tại các thời gian

khác nhau, enzyme được lấy ra để xác định hoạt tính. Hoạt tính của enzyme được xác

định như phần 3.3.3. Thời gian được kéo dài tới thời gian bán hủy của enzyme (thời

gian mà hoạt tính enzyme còn 50%).

3.3.8.2 Phương pháp xác định pH tối ưu và độ bền pH

Tiến hành thử nghiệm với các mức pH từ 3 đến 8 trong đệm Britton- Robinson

(40mM sodium citrate, 40mM sodium phosphate, 40mM borate, sử dụng NaOH 0,2M

để chỉnh pH về giá trị mong muốn). Hoạt tính enzyme được xác định dựa vào cách xác

định hoạt tính enzyme chuẩn như phần 3.3.3.

Độ bền pH được xác định tại các pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 ở 37 0C. Tại các thời điểm

khác nhau, enzyme được lấy ra để xác định hoạt tính, hoạt tính của enzyme được xá

định như phần 3.3.3. Thời gian được kéo dài đến thờ gian bán hủy của enzyme (thời

gian mà hoạt tính enzyme còn 50%).

3.3.8.3. Phương pháp xác định sự ảnh hưởng của các cation kim loại đến hoạt

tính của enzyme β- galactosidase

Các cation kim loại được bổ sung vào cơ chất oNPG trong đệm phosphate với

nồng độ là 5-15 mM, sau đó phản ứng được tiến hành như với phản ứng enzyme chuẩn

trong phần 3.3.3 và xác định hoạt tính enzyme β-glalactosidase. Sự ảnh hưởng của các

cation kim loại đến hoạt tính enzyme β-glalactosidase được xác định bằng cách so



21



sánh hoạt tính của enzyme trong các mẫu có cation và khơng có cation thêm vào trong

cùng điều kiện. Phản ứng thực hiện có mặt của các cation Ca 2+, Cu2+, Fe2+, K+, Zn2+.



22



PHẦN THỨ TƯ – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả sàng lọc các chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase

Từ 160 chủng vi khuẩn Bacillus sử dụng trong nghiên cứu có 26 chủng vi khuẩn

có khả năng thủy phân X-gal, tạo khuẩn lạc màu xanh, mức độ đậm nhạt của màu sắc

và thời gian xuất hiện màu xanh của khuẩn lạc được thể hiện ở hình 1 và bảng 1.



Chủng có màu xanh

đậm NT 2.8



Chủng có màu xanh nhạt NT 2.6

và chủng khơng xuất hiện màu

xanh (NT2.9, DC3,TO2.5)



Hình 1. Màu của khuẩn lạc khi thủy phân X-gal của chủng minh họa (NT2.8, NT2.6, NT 2.9)

Bảng 1. Kết quả định tính thủy phân X-gal của vi khuẩn Bacillus

STT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13



Mức độ

màu sắc

NT2.6

+

NT2.7

+++

NT2.8

++++

DC1

+++

DC2

+++

DC6

++

DC2.6

+

DC4.8

+

DC5.3

+

TO1.1

+++

TO1.8

+++

TO2.4

+

TO2.6

+

Chú thích: DC, TO, NT mã hố lần

Ký hiệu chủng



STT

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

lượt



Mức độ

màu sắc

TO2.10

+

TO3.10

+

TO4.5

++

TO5.5

++

TO6.1

++

TO6.6

+

TO7.1

+

TO7.2

+

TO7.3

+

TO8.6

+

TO9.9

+

TO10.1

+

TO10.6

+

cho các mẫu phân lập từ dạ cỏ bò,

Tên chủng



tương ớt và nước thải nhà máy sữa

Kết quả ở bảng 1 cho thấy trong 26 chủng có hoạt độ β-galactosidase có 6 chủng

là NT2.7, NT2.8, DC1, DC2, TO1.1 và TO1.8 cho màu xanh đậm được coi là các

23



chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme β- galactosidase cao. Chủng có màu sắc đậm

nhất là chủng NT2.8. 6 chủng này được sử dụng để tiếp tục đi xác định hoạt độ của

enzyme.

4.2. Xác định hoạt độ của enzyme β–galactosidase của vi khuẩn

Kết quả xác định hoạt độ β-galactosidase của 6 chủng được thể hiện ở bảng 2.

Bảng 2. Kết quả xác định hoạt độ β-galactosidase ngoại bào của 6 chủng vi khuẩn

STT

1

2

3

4

5

6



Tên chủng

NT2.8

NT2.7

DC1

DC2

TO1.1

TO1.8



U/L dịch nuôi

42.4

5.4

5.3

6.2

5.2

6.5



Kết quả bảng 2 cho thấy trong 6 chủng vi khuẩn được chọn để xác định hoạt độ

β-galactosidase thì chủng Bacillus NT2.8 cho hoạt độ cao, nổi trội nhất và đạt 42.4

U/l. Kết quả xác định khả năng sinh β-galactosidase bằng phương pháp đĩa thạch có sự

tương đồng với phương pháp xác định hoạt độ của enzyme. Chủng vi khuẩn Bacillus

NT2.8 được sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.

4.3. Xác định đặc tính của β-galactosidase từ chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8

4.3.1. Xác định vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy phân có đặc tính chịu nhiệt

Nhiệt độ có tác động mạnh mẽ tới độ bền của enzyme, gây ảnh hưởng đến hoạt

độ xúc tác của enzyme. Dịch enzyme thô được ủ ở nhiệt độ 30oC, 50oC và 60ºC trong

vòng 50 giờ, ở thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ,… 50 giờ enzyme thô được lấy ra để xác

định độ bền nhiệt như mô tả ở mục 2.2.3. Kết quả được thể hiện ở hình 2.



24



Hình 2. Độ bền nhiệt của β-galactosidase tử chủng Bacillus NT2.8 ở 30, 50 và 60oC

Kết quả ở hình 2 so sánh độ bền của enzyme ở nhiệt độ 30oC, 50oC và 60oC.

Hoạt độ của enzyme bền nhất ở 30oC, giảm dần khi nhiệt độ tăng lên và thấp nhất ở

60oC. Mặc dù vậy, kết quả cho thấy enzyme cũng rất bền ở 60oC. Cụ thể, sau 4 giờ ủ ở

60oC hoạt độ enzyme còn lại là 80,3% so với hoạt độ ban đầu, hoạt độ của enzyme

giảm chậm trong suốt 50 giờ ủ và còn lại 50,6% so với hoạt độ đầu tiên sau 50 giờ. So

sánh với nhiệt độ 50oC, hoạt độ của enzyme ở 50 giờ còn lại là 71% cao hơn so với

hoạt độ enzyme ở nhiệt độ 60 oC. Từ kết quả trên ta có thể kết luận chủng vi khuẩn

Bacillus NT2.8 có khả năng sinh enzyme β-galactosidase rất bền ở nhiệt độ nghiên

cứu, kể cả ở 60oC. Kết quả này tương tự kết quả của Chen W và cs, 2008 khi nghiên

cứu tính bền nhiệt của β-galactosidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus

stearothemophilus, ở 60ºC trong 50 giờ thì hoạt độ enzyme vẫn giữ được 50% so với

hoạt độ ban đầu. Nghiên cứu của Shaikh SA và cs, 1999 chỉ ra enzyme β-galactosidase

sinh ra từ nấm ưa nhiệt Rhizomucor sp có khả năng bền ở nhiệt độ 60ºC trong vòng 4

giờ, hoạt độ enzyme còn lại 50% so với ban đầu trong 2,5 giờ. Kết quả này cho thấy βgalactosidase từ vi khuẩn Bacillus NT2.8 có khả năng bền nhiệt cao hơn rất nhiều so

với β-galactosidase từ Rhizomucor sp.

4.4. Định danh chủng được tuyển chọn bằng phương pháp xác định định

trình tự gen 16S rRNA

Kết quả định tính, định lượng và kiểm tra các đặc tính của enzyme cho thấy vi

khuẩn Bacillus NT2.8 có khả năng sinh enzyme β-galactosidase cao, chịu nhiệt ở

60ºC. Vì vậy, chủng này tiếp tục được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử.

3.4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách chạy điện

di agarose .



1



2

/



25



Hình 3. Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ sinh khối vi khuẩn chủng Bacillus

NT2.8

Giếng số 1: Thang DNA chuẩn 100 bp DNA ladder, New England Biolabs

Giếng số 2: DNA tổng số tinh sạch

Kết quả ở hình 3 cho thấy mẫu tách chiết chỉ xuất hiện một vạch lớn hơn so với

thang DNA chuẩn, khẳng định DNA tổng số sạch, có thể sử dụng cho chạy phản ứng

PCR tiếp theo.

4.4.2. Kết quả PCR với cặp mồi 27F/1492R

Để định danh chính xác chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 được phân lập từ nước

thải nhà máy sữa, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi 27F và 1492R để nhân

toàn bộ vùng gen mã hóa tiểu phần 16S RNA ribosome. Kết quả PCR được thể hiện

trong hình 4



Hình 4. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số

chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8



26



Giếng số 1: Thang DNA chuẩn thang DNA chuẩn 100 bp DNA ladder, New

England Biolabs

Giếng số 2: sản phẩm PCR

Kết quả PCR cho thấy mẫu vi khuẩn NT2.8 tạo băng sản phẩm ~ 1500bp đúng

như dự kiến. Sản phẩm PCR được tinh sạch và sử dụng làm khn để giải trình tự

gene.

4.4.3. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA

Trình tự thu được từ vùng gen mã hóa 16S rRNA có kích thước 1500bp, tín hiệu

rõ khơng nhòe, khơng bị trùng các đỉnh tín hiệu. Sau khi tiến hành xử lý các tín hiệu

nhiễu, trình tự đoạn gen được so sánh trên ngân hàng Gen (Genebank) sử dụng công

cụ BLAST. Kết quả so sánh trình tự cho thấy Bacillus NT2.8 được phân lập từ nước

thải nhà máy sữa là vi khuẩn Bacillus flexus và được đặt tên là Bacillus flexus NT2.8.

Bacillus flexus thường được phân lập từ đất nuôi gia cầm, đất tự nhiên, nhiệt độ phát

triển từ 17 – 37 oC, nhiệt độ phát triển tối ưu 30 oC, khoảng pH phát triển từ 4,5 – 9,5

với nồng độ muối từ 2 – 10%. Nghiên cứu của Francois và cs, 2014 đã chỉ ra rằng vi

khuẩn Bacillus flexus XJX-1 có khả năng sinh đồng thời các enzyme amylase kiềm, lipase

kiềm và protease kiềm, ứng dụng trong công nghiệp chất tẩy rửa. Cho đến nay, chưa có

một nghiên cứu nào cơng bố về vi khuẩn Bacillus flexus có khả năng sinh βgalactosidase bền nhiệt.

4.5 Kết quả tinh sạch enzyme protease bằng muối (NH4)2SO4.

Dịch β-galactosidase tinh sạch của chủng Bacillus flexus NT2.8 được xác định

hàm lượng protein theo phương pháp Bradford, hàm lượng protein trong mẫu được

tính theo phương trình đường chuẩn protein. Hoạt tính protease xác định bằng phương

pháp như mục 3.3.3. Thí nghiệm luôn được lặp lại ba lần và lấy giá trị trung bình. Kết

quả thu được trong (bảng 3).

Bảng 3 Kết quả tinh sạch enzyme bằng (NH4)2SO4

Thể tích



Tổng hoạt



Tổng



Hoạt tính



Hiệu suất



(ml)



tính (U)



protein(mg)



riêng (U/mg)



thu hồi (%)



Trước tinh sạch



25



11.265



56.8



0.198



100



40%



5



3.244



14.277



0.227



28.80



50%



5



7.957



11.746



0.677



70.63



Tinh sạch



27



60%



5



9.75



15.257



0.639



86.55



70%



5



5.352



20.098



0.266



47.51



Chúng tơi dựa vào hoạt tính riêng của enzyme β-galactosidase để xác định khả

năng kết tủa enzyme β-galactosidase của (NH 4)2SO4. Hoạt tính riêng càng cao chứng

tỏ khả năng kết tủa (NH4)2SO4 càng tốt, độ sạch của enzyme càng cao. Qua khảo sát

kết quả của 5 ml enzyme tinh sạch với nồng độ muối (NH4)2SO4 khác nhau, chúng tơi

nhận thấy hoạt tính riêng của enzyme khi tinh sạch bằng 60% muối (NH 4)2SO4 là cao

nhất bằng 0.639 (U/mg)

4.6 Kết quả xác định đặc tính enzyme

4.6.1. Kết quả xác định độ bền nhiệt độ cao (60°C) của enzyme sau tinh sạch

Sau khi tinh sạch chúng tôi tiếp tục đi xác định khả năng bền nhiệt của enzyme

β-galactosidase từ chủng Bacillus NT2.8. Kết quả đươc thể hiện ở hình 5.



Hình 5. Độ bền nhiệt của β-galactosidase từ chủng Bacillus NT2.8 ở 60oC

Kết quả ở hình 5 xác định độ bền của enzyme ở 60oC. Kết quả cho thấy enzyme

sau tinh sạch vẫn rất bền ở 60oC. Cụ thể, sau 30 giờ đầu ủ ở 60oC hoạt độ enzyme còn

lại là 83,02% so với hoạt độ ban đầu, hoạt độ của enzyme giảm chậm trong suốt 50 giờ

ủ và còn lại 55,42% so với hoạt độ đầu tiên sau 50 giờ. Từ kết quả trên ta có thể kết

luận chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 có khả năng sinh enzyme β-galactosidase rất bền

ở nhiệt ở 60oC.

4.6.2. Kết quả xác định pH tối ưu của enzyme sau tinh sạch

Dịch β-galactosidase sau tinh sạch của chủng Bacillus flexus NT2.8 được xác

28



định hàm pH tối ưu theo phương pháp như mơ tả ở mục 3.3.8.2.Kết quả được thể hiện

như hình 6 dưới đây:



Hình 6. pH tối ưu của enzyme β-galactosidase tử chủng Bacillus NT2.8

Từ hình 6 ta thấy hoạt tính enzyme β-galactosidase tăng lên khi pH tăng từ 3

đến 7. Ở pH = 3 họat tính tương đối của enzyme là 19.41% tăng dần lên và đạt giá trị

cao nhất ở pH = 7. Ở pH từ đến 7 đến 8 hoạt tính enzyme giảm và hoạt tính tương đối

còn 65% . Vậy pH tối ưu cho hoạt động của enzyme β-galactosidase là pH =7.



29



PHẦN THỨ NĂM – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

- 26/160 chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu có kết quả sinh enzyme βgalactosidase khi định tính trên mơi trường có X-gal và chất cảm ứng IPTG. Trong đó

6 chủng (NT2.7, NT2.8, DC1, DC2, TO1.1,TO1.8) có màu xanh đậm nhất và thời gian

xuất hiện màu sớm nhất được tuyển chọn để tiến hành xác định hoạt tính của enzyme.

- Từ 6 chủng được tuyển chọn, sau khi xác định hoạt tính của enzyme đã xác

định chủng NT 2.8, có hoạt độ cao đạt 42.4 U/l nổi trội hơn được sử dụng để kiểm tra

tính bền ở nhiệt độ 60ºC

+ Độ bền nhiệt: Enzyme rất bền nhiệt ở 60ºC, hoạt độ của enzyme ở 50 giờ còn

lại là 71% cao hơn so với hoạt độ ban đầu

- Đã giải trình tự và định danh được chủng Bacillus NT 2.8 là vi khuẩn Bacillus

flexus và đặt tên là Bacillus flexus NT 2.8.

- Sau khi tinh sạch enzyme β-galactosidase bằng muối (NH4)2SO4 nhận thấy hoạt

tính riêng của enzyme khi tinh sạch bằng muối (NH 4)2SO4 60% là cao nhất bằng 0.639

(U/mg)

- Đã xác định được pH tối ưu của enzyme β-galactosidase từ chủng Bacillus

flexus NT 2.8 là pH 7

5.2. Kiến nghị

Do thời gian nghiên cũng như điều kiện nghiên cứu còn hạn chế nên chúng tơi

bước đầu mới chỉ tinh sạch bằng muối (NH 4)2SO4 và xác định được một số đặc tính

của enzyme β-galactosidase mà chưa tiến hành được một số thí nghiệm như mong

muốn. Vì vậy chúng tơi có một số đề nghị cho nghiên cứu tiếp theo như sau:

-



Tinh sạch enzyme β-galactosidase từ chủng NT 2.8 bằng sắc ký lọc gel



-



Điện di để xác định khả năng tinh sạch enzyme



30



TÀI LIỆU THAM KHẢO



Chen, W., Chen, H., Xia, Y., Zhao, J., Tian, F., Zhang, H. (2008). Production,

purification, and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk

lactose hydrolysis from Bacillus stearothermophilus. J Dairy Sci. 91(5):1751-58.

Coenen, T.M.M; Bertens, A.M.C; Hoog, S.C.M.de; Verspeek Rip, C.M. (2000). Safety

evaluation of a lactase enzyme perpartion derived from Kluyveromyces.

Đặng Thị Thu và cộng sự (2012), Công nghệ enzyme, NXB Khoa học và Kỹ thuật.

Đặng Thị Thu, Nguyễn Văn Cách, Bùi Thị Hải Hòa. (2007). Tuyển chọn và nghiên

cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp β-galactosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus

oryzae. Tạp chí Khoa học và cơng nghệ. 45 (1): 23 - 31

Davail, S., Feller, G., Narinx, E., Gerday, C. (1994). Cold adaptation of protein. J Biol

Chem, 269.

Driks A (1999). Bacillus subtilis spore coat, Microbiology and Molecular Biology

Reviews 63. 1.

Francois N, N., Sunils S, M. (2014). Concomitant production of detergen compatible

enzymes by Bacillus flexus XJX-1. Braz. J. Microbiol. 45(3): 903 – 910.

Harju M, Kallioinen H, Tossavainen O (2012), Lactose hydrolysis and other

conversions in dairy products: technological aspects, Int Dairy J, 22, 104-109.

Nakayama, T., Amachi, T. (1999). β-galactosidase, enzymology. Encyclopedia of

Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation. 3: 1291-1305.

Ngô Xuân Mạnh, Võ Nhân Hậu, Nguyễn Thị Tú. (2006). Nghiên cứu các điều kiện tối

ưu cho việc thu nhận α-amylase chịu nhiệt từ vi khuẩn Bacillus lichenifomis. Tạp chí

Khoa học và Nơng nghiệp 5(1): 412 – 416.

Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí

Minh.



31



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Bước 2: Mẫu thí nghiệm

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×