Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tải bản đầy đủ - 0trang

hóa được khối lượng cơ chất lớn hơn một ngàn lần khối lượng cơ thể chúng. Để

chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn như vậy, chúng phải tổng hợp ra được lượng

enzyme rất lớn. Bởi vì, mọi chuyển hóa cơ chất trong tế bào là do enzyme đảm nhận.

Chính vì thế, nếu sử dụng vi sinh vật như nguồn sinh học để sản xuất enzyme rất có

lợi. Trong một khoảng thời gian ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn

(để thu enzyme nội bào) mà còn thu được lượng enzyme ngoại bào vừa nhiều, vừa có

hoạt tính riêng rất cao.

(2) Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao. Ưu điểm này gắn liền với

tốc độ chuyển hóa cơ chất và gắn liền với tốc độ sinh sản và phát triển của vi sinh vật.

(3) Vi sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp. Trong sản

xuất này, q trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hồn

tồn khơng phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài như sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và

động vật.

(4) Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và

dễ kiếm. Đây cũng chính là lợi thế rất quan trọng. Nhờ đó, ta có thể làm giảm giá

thành sản phẩm và có thể sản xuất ở mọi nơi trên thế giới.

2.1.3. Enzyme β-galactosidase từ vi khuẩn

β-galactosidase ở vi khuẩn có thể ở dạng ngoại bào hoặc nội bào (Davail và cs,

1994). Enzyme ngoại bào dễ tách, không phải phá vỡ tế bào, không lẫn chung với các

thành phần nội bào, nếu có chỉ là một enzyme ngoại bào khác, có tính bền vững mạnh,

phương pháp tinh sạch dễ và rẻ tiền. Enzyme nội bào khó tách, phải phá vỡ tế bào,

thường lẫn chung với các chất khác của tế bào sau khi phá vỡ (acid nucleic, chất nguyên

sinh, lipid,…), chỉ bền vững ở trong mơi trường nội bào, phương pháp tinh sạch khó

thực hiện, quy trình cơng nghệ phức tạp, giá thành đắt. β-galactosidase ngoại bào được

tổng hợp sau đó tiết ra ngồi tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân các hợp chất

hữu cơ bên ngồi mơi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2004). Đây là một

enzyme thích ứng điển hình, được tổng hợp khi trong mơi trường chỉ có lactose hay các

chất có cấu trúc tương tự lactose như axit lactobiotic. β-galactosidase của vi khuẩn có

khối lượng phân tử khá lớn (trên 100 kDa), thường hoạt động tối ưu ở 37ºC trong điều

kiện môi trường pH trung tính 6.0 - 8.0 (Trương Nam Hải và cs, 2004).

Vi khuẩn E. coli là đối tượng được nghiên cứu đầu tiên. Cấu trúc bậc ba của

enzyme từ E. coli cũng như cơ chế điều hòa phiên mã của gene lacZ đã được khẳng

7



định tạo điều kiện cho việc nghiên cứu kỹ hơn về cơ chế xúc tác của enzyme này. Mặc

dù vậy, việc sử dụng enzyme này vào các quá trình sinh học chỉ được kiểm nghiệm ở

quy mơ phòng thí nghiệm do vi khuẩn này khơng được phép có mặt trong thực phẩm.

Lĩnh vực chủ yếu của enzyme từ vi khuẩn E. coli này là trong nghiên cứu sinh học

phân tử, trong kỹ nghệ và trong hóa miễn dịch.

Enzyme β-galactosidase từ Streptcoccus thermophiles – một trong những vi

khuẩn được sử dụng ở công nghệ chế biến các sản phẩm lên men từ sữa cũng đã được

sử dụng để thủy phân lactose trong sữa ở quy mô công nghiệp do tính bền nhiệt mà độ

an tồn khi được sử dụng dưới dạng phụ gia thực phẩm. Nó cũng được dùng làm chất

xúc tác cho quá trình sản xuất các galacto-oligosaccharides từ lactose do hoạt tính

chuyển hóa galactozyl của nó cao. Đối với vi khuẩn chúng có thể phát triển tối ưu

trong dải pH từ 6.5 đến 7.5. Chúng kém phát triển ở pH dưới 4 hoặc trên 8 (Coenen và

cs, 2000).

Một số β-galactosidase từ vi khuẩn để có hoạt tính cần phải có mặt các ion hóa trị

1 hoặc các ion hóa trị 2. Ví dụ như β-galactosidase từ S. restivirgula cần phải có mặt

nhiều ion kim loại hóa trị 2 để đạt đến độ bền nhiệt và hoạt tính tối đa. Tuy nhiên, một

số β-galactosidase khác lại không cần sự có mặt của các ion kim loại như enzyme từ

Rhizobium melioti (Toru Nakayama và cs, 1996).

2.2. Ứng dụng của β-galactosidase

Enzyme β-galactosidase có vai trò vơ cùng to lớn trong ngành cơng nghiệp thực

phẩm nói chung và ngành cơng nghiệp chế biến sữa nói riêng, ứng dụng chính là thủy

phân lactose trong sữa thành glucose và galactose (Davail và cs, 1994). Thủy phân

lactose trong whey là một trong ứng dụng quan trọng của β-galactosidase trong ngành

công nghiệp chế biến sữa, giúp làm tăng độ ngọt của sản phẩm (Rosenberg M, 2006).

Enzyme này được sử dụng trong ngành công nghiệp sữa để sản xuất sữa và các sản

phẩm sữa khơng có lactose, khắc phục tình trạng khơng dung nạp lactose ở con người

(Haju và cs, 2012).

Ngồi ra, sữa khơng lactose được sử dụng cho việc chế biến hương liệu sữa, phô

mai, và sữa chua. Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng sữa chế biến thực phẩm

cũng ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và sản phẩm sữa cô đặc. Hơn

nữa, việc sử dụng sữa đã thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làm tăng

q trình axit hóa, bởi vì thủy phân lactose thường là bước làm chậm tốc độ của quá

8



trình, làm giảm thời gian đông đặc của sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc và

hương vị cho pho mát (Parmjit S Panesar và cs, 2010). Chất lượng của sữa đông lạnh

và kem làm từ sữa cũng được cải thiện đáng kể khi thêm enzyme β-galactosidase. Nó

chống lại sự kết tinh đường lactose bằng cách thủy phân thành glucose và galactose và

làm giảm cấu trúc cát sạn.

Từ những ứng dụng thực tiễn trên mà β-galactosidase đã được các nhà khoa học

quan tâm để sản xuất enzyme từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau, để có tiến hành

nghiên cứu sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp.

2.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất β-galactosidase trong và ngồi nước

2.3.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước thuộc lĩnh vực của đề tài

Nhóm của Nguyễn Thu Hà và cs, 2006 đã nghiên cứu sự biểu hiện của enzyme

lactase ở 2 chủng Lactobacilus reuteri L103 và L461 với mục đích xác định mức độ

biểu hiện của gene mã hóa cho enzyme này và bước đầu xác định một số đặc tính của

enzyme. Kết quả chỉ ra rằng enzyme có cấu tạo gồm 2 tiểu phần (2 chuỗi peptide có

trọng lượng là 35kDa và 85kDa), có khả năng chuyển hóa và tạo ra các prebioticoligosaccharide. Các enzyme này có khoảng pH hoạt động hẹp, một enzyme từ pH 3.8

– 4.0 (chủng L461) và một pH 4.6 – 4.8 (chủng L103). Tuy nhiên, kết quả bền nhiệt

không được chỉ ra ở nghiên cứu này.

Nguyễn Văn Cách và cs, 2008 đã tạo dòng β-galactosidase từ Aspergillus oryzae

và xác định một số tính chất lý-hóa của nó. Trần Văn Giang và cs, 2008 đã tạo dòng và

phân tích trình tự gen mã hóa β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis G1. Tuy nhiên,

các thông tin về độ bền nhiệt của enzyme chưa được đưa ra một cách cụ thể. Ngồi ra

còn có cơng trình nghiên cứu của Trương Nam Hải và cs với đề tài cấp quốc gia

“Nghiên cứu, phân lập và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp

enzyme beta-galactosidase có hiệu suất cao và ứng dụng trong thực phẩm” đã thành

công trong biểu hiện của và xác đinh hoạt tính β-galactosidase, nhưng việc biểu hiện

trong E.coli lại khơng an tồn trong thực phẩm, protein thu được đa phần là enzyme

nội bào dẫn đến gặp khó khăn trong việc thu hồi enzyme có hoạt tính cao ứng dụng

trong quy mơ cơng nghiệp. Vì vậy, ở Việt Nam những nghiên cứu về β-galactosidase

mới dừng lại ở nghiên cứu cơ bản và chưa đưa vào sản xuất enzyme này. Vì vậy, việc

nghiên cứu tuyển chọn và định danh được các chủng Bacillus với các ưu điểm nổi bật

so với Escherichia coli như an toàn thực phẩm, dễ sinh enzyme bền ở nhiệt độ cao

9



(Driks, 1999). Enzyme thu nhận được xác định hoạt tính, kiểm tra khả năng chịu nhiệt

để có thể sử dụng trong các quá trình chế biến cần phải gia nhiệt ở nhiệt độ cao trong

các sản phẩm chế biến từ sữa là hết sức cần thiết.

2.1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu nước ngoài thuộc lĩnh vực của đề tài

Trên thế giới việc tạo dòng và nghiên cứu sản xuất enzyme β-galactosidase đã

được biết đến từ lâu. Một vài cơng trình tiêu biểu của Petzelbauer và cs, 2000, Hanson

và Adlercreutz, 2001, Splechtna và cs, 2001, Petzelbauer và cs, 2002, Park và cs, 2008,

,… cho thấy nguồn gen mã hóa β-galactosidase đã được phân lập từ các nguồn vi

khuẩn khác nhau và được tạo dòng và biểu hiện trong E.coli. Các nghiên cứu này là

các nghiên cứu cơ bản, với mục đích để nghiên cứu sự biểu hiện của gene mã hóa cho

β-galactosidase trong E.coli và thuận tiện cho việc tinh sạch và xác định hoạt tính của

enzyme.

Một số cơng trình cơng bố về tạo dòng và biểu hiện β-galactosidase từ vi khuẩn

lactic (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri) trong vật chủ là vi khuẩn

Lactobacillus plantarum (Nguyễn TT và cs, 2012). Kết quả chỉ ra rằng enzyme biểu

hiện cao, chịu nhiệt ở 50oC khi có sự bổ sung Ca2+ trong phản ứng. Tuy nhiên, mục

đích của nghiên cứu này là sản xuất enzyme xúc tác tạo galactooligosaccharide, vector

biểu hiện vẫn còn gene kháng kháng sinh nên chưa đảm bảo an toàn trong thực phẩm.

2.4. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus

2.4.1. Các đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương. Thuộc chi Bacillaceae, có nội

bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với

các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng

dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí khơng bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc

chuỗi và chuyển động bằng tiên mao.



Hình 2.4. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus

10



Hình 2.5. Hình thái vi khuẩn Bacillus qua kính hiển vi quang học

Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất

dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ

rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,… (Priest FG và

Grigorova R, 1991).

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử

dụng các chất hữu cơ đa dạng như đường, amino acid, acid hữu cơ,… Một vài lồi có

thể lên men carbohydrate tạo thành glycerol và butanediol, một vài lồi như Bacillus

megaterium thì khơng cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài lồi khác thì cần

amino axit, vitamin nhóm B. Hầu hết đều là lồi ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối

ưu là 30-450C, nhưng cũng có một số loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65 0C

(Rosovitz M J và cs, 1998).

Đa số Bacillus sinh trưởng với pH = 7, một số phù hợp với pH = 9-10 như

Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với với pH = 2-6 như Bacillus

acidocaldrius (Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009).

2.4.2. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sinh enzyme β-galactosidase

Các chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh tổng hợp mạnh mẽ nhiều enzyme

khác nhau. Enzyme sản sinh bởi vi khuẩn Bacillus hầu hết là emzyme ngoại bào nên

dễ dàng cho việc thu nhận ở quy mô công nghiệp. Ngoài ra, trong tự nhiên nhiều

chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng chịu nhiệt của một số chủng vi khuẩn, nên

enzyme ngoại bào của loài vi khuẩn này cũng có tiềm năng cao về tính bền nhiệt ở

nhiệt độ cao.

Nghiên cứu của Chen và cs (2008) đã chỉ ra được nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt

động của β-galactosidase của vi khuẩn Bacillus Stearothermophilus là ở 70ºC và pH

7.0. Xác định được độ bền nhiệt của enzyme này ở 65ºC trong 50 giờ và 70ºC, trong 9

11



giờ thì hoạt độ β-galactosidase vẫn giữ được 50% so với ban đầu. Enzyme chịu nhiệt

tái tổ hợp của vi khuẩn này ứng dụng cho cả hai quá trình thủy phân lactose và sản

xuất galactose-oligosaccharides trong chế biến sữa.

Các nghiên cứu chỉ ra được tính bền nhiệt của các chủng vi khuẩn Bacillus chủ

yếu hoạt động ở pH trung tính, những nghiên cứu về khả năng hoạt động ở pH axit của

vi khuẩn Bacillus vẫn còn hạn chế. Vì vậy mà việc nghiên cứu khả năng sinh βgalactosidase có khả năng chịu nhiệt và chịu pH axit từ vi khuẩn Bacillus để ứng dụng

trong các ngành công nghiệp thực phẩm trở nên vô cùng cấp thiết.



12



PHẦN THỨ BA - ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng nghiên cứu

160 chủng vi khuẩn Bacillus spp. phân lập từ dạ cỏ bò, tương ớt, thịt lên men,

nước thải nhà máy sữa, sữa chua lên men, lòng non lợn ở các vùng khác nhau đã được

định danh sơ bộ bằng phương pháp hình thái, sinh hố được sử dụng để tuyển chọn

chủng sinh enzyme β - galactosidase chịu nhiệt.

3.2. Nội dung nghiên cứu

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus đã được định danh sơ bộ từ ngân hàng

chủng cuả Khoa công nghệ thực phẩm có khả năng sinh enzyme β-galactosidase

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt

- Định danh chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt bằng

phương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA.

- Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme: ảnh hưởng của

nhiệt độ, ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của enzyme

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Phương pháp hoạt hóa giống và ni cấy giống để thu dịch enzyme

ngoại bào

Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống được tiến hành theo Nguyễn Lân Dũng

và (1978) và được mô tả như sau:

-Phương pháp hoạt hóa giống

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml mơi trường NB, đem hấp khử trùng ở 121oC,

1atm, trong 20 phút. Dùng đầu que cấy nhọn tiệt trùng lấy khuẩn lạc và cho vào ống

nghiệm. Nút miệng ống nghiệm bằng nút bông, đánh dấu tên chủng, thời gian cấy. Các

thao tác thí nghiệm đều được thực hiện trong buồng cấy vi sinh và dưới ngọn lửa đèn

cồn. Sau đó, các ống nghiệm được chuyển vào tủ nuôi cấy, nuôi ở 37 oC, lắc 200

vòng/phút trong vòng 24 giờ.

-Phương pháp ni cấy giống để thu dịch enzyme ngoại bào

Tiếp giống 1% từ ống nghiệm hoạt hóa vào bình tam giác chứa mơi trường NB

có bổ sung 1% đường lactose đã hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút và nuôi cấy ở 37

o



C, lắc 200 vòng/phút trong 24h. Tiến hành li tâm 6000 vòng/ phút ở 4 oC trong 20

13



phút, gạn lấy phần dịch nổi bảo quản ở 4 oC để xác định khả năng sinh enzyme β –

galactosidase.

3.3.2. Xác định khả năng sinh β- galactosidase bằng phương pháp đĩa thạch

Khả năng sinh β-galactosidase của các chủng Bacillus được xác định theo

phương pháp của Toru Nakayama và Teruo Amachi, 1996, được mô tả như sau:

Nguyên tắc: β-galactosidase thuỷ phân X-gal hình thành sản phẩm kết tủa màu

xanh da trời kiểu indigo. Vì vậy, vi khuẩn dương tính với enzyme này sẽ tạo khuẩn lạc

màu xanh khi nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch bổ sung chỉ thị X-gal và chất cảm

ứng IPTG hoặc lactose.

- Cách 1: Xác định khả năng sinh β-galactosidase bằng phương pháp cấy trang

trên đĩa thạch

+ Môi trường NA được hấp vơ trùng và làm nguội, sau đó dùng micropipet hút,

bổ sung 60 µl X-gạl nồng độ 20 mg/ml và 10 µl IPTG 0,1 M trên mỗi đĩa, trang đều.

+ Hút 3 µl dịch khuẩn đã được hoạt hóa ở phần 3.3.1 lên các đĩa thạch chỉ thị

này, trang đều.

+ Đĩa cấy vi sinh vật được đưa vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37 ⁰C, trong điều kiện

tối. Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h và 72h.

- Cách 2: Xác định khả năng sinh β-galactosidase bằng phương pháp nhỏ dịch

nuôi cấy trên đĩa thạch

+ Môi trường NA được hấp vơ trùng và làm nguội, sau đó dùng micropipet hút

và bổ sung 60 µl X-gal nồng độ 20 mg/ml và 10 µl IPTG 0,1 M trên mỗi đĩa, trang đều

+ Hút 3 µl dịch khuẩn, đã được hoạt hóa ở phần 3.3.1 nhỏ trên bề mặt đĩa thạch

chỉ thị, để khô dịch khuẩn trong 5 phút.

+ Đĩa làm xong được đưa vào tủ nuôi ở nhiệt độ 37 ⁰C, trong điều kiện tối.

Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h và 72h.

- Cách 3: Xác định khả năng sinh β-galactosidase bằng phương pháp cấy ria trên

đĩa thạch

+ Môi trường NA được hấp vơ trùng và làm nguội, sau đó dùng micropipet hút

và bổ sung 60 µl X-gal nồng độ 20 mg/ml và 10 µl IPTG 0,1 M trên mỗi đĩa, trang đều

+ Tiến hành lấy khuẩn lạc cấy ria chủng vi khuẩn trên mỗi đĩa

+ Đĩa cấy vi sinh vật được đưa vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37 ⁰C, trong điều kiện

tối. Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h và 72h.

14



3.3.3. Xác định hoạt độ của β-galactosidase ngoại bào

Hoạt độ của β-galactosidase được xác định theo phương pháp của Nguyen và cs,

2006, được mô tả như sau:

Nguyên tắc: Hoạt độ β-galactosidase được xác định bằng cách cho enzyme này

phản ứng với cơ chất tổng hợp o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (oNPG). Dưới tác

dụng của β-galactosidase, oNPG sẽ thủy phân thành galactose và o-nitrophenol. onitrophenol khi giải phóng sẽ chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng và hấp thụ

(Abs) ở bước sóng cực đại 420 nm.

- Bước 1: Xây dựng đường chuẩn oNP

Các dung dịch

1

Vdung dịch gốc (ml)

0

Vdung dịch đệm (ml)

5

Nồng độ (mM)

0

Dùng 0.5ml oNP và 0.75ml



2

3

4

5

0.1

0.2

0.3

0.4

4

3

2

1

0.4

0.8

1.2

1.6

Na 2CO3 đo ở bước sóng 420nm, dựa vào



6

0.5

0

2.0

sự tương



quan giữa nồng độ oNP và giá trị OD ở bước sóng 420nm xác định được tốc độ

phản ứng của oNP qua đường chuẩn dựng bằng phần mềm Excel.

Bảng 3.1. Số liệu dựng đường chuẩn oNP

STT

Nồng độ



1

0



2

0.04



3

0.08



4

0.12



5

0.16



6

0.2



oNP (mM)

Abs



0.0045



0.1326



0.2624



0.3878



0.5078



0.6336



Hình 3.1 Đường chuẩn oNP

- Bước 2: Xác định hoạt tính của enzyme



15



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×