Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tải bản đầy đủ - 0trang

VN

U



Kết quả phần chiết xuất như hình 3.1 cho thấy:



+ Hàm lượng cao tổng thấp chiếm 4,3% so với khối lượng mẫu dược

liệu khô.



an



dP

ha

rm



ac

y,



+ Lượng cao phân đoạn được sắp xếp như sau: cao phân đoạn nước

> cao phân đoạn DCM > cao phân đoạn EtOAc > cao phân đoạn n-hexan.

Như vậy, lượng cao phân đoạn DCM khá nhiều chỉ sau phân đoạn nước,

kết quả này gợi các chất có độ phân cực trung bình có hàm lượng khá cao

trong dược liệu nghiên cứu - Nấm Cổ cò. Mặc dù, như trong phần tổng quan

về nấm Cổ cò thì chưa có cơng bố nào về thành phần hóa học nhưng các

nghiên cứu về loài cùng chi là loài nấm Linh chi – Ganoderma lucidum các

hợp chất có độ phân cực trung bình này thường là các ergosterol hoặc

lanostan-triterpen.

Tiến hành sắc ký lớp mỏng (TLC) các phân đoạn n-hexan, DCM,



ine



EtOAc và cao tổng để xác định hệ dung môi sắc ký cột.

B



Sc



ho

ol



of



M



ed

ic



A



1



2



3



4



1



2



3



4



@



Hình 3.2. Sắc ký đồ TLC cao tổng và các cao phân đoạn

nấm Cổ cò.



rig



ht



(Hình A: Sắc ký đồ TLC dưới ánh sáng thường, sau khi phun thuốc thử

H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối, tº



Co



py



Hình B: Sắc ký đồ TLC tại bước sóng 366 nm, sau khi phun thuốc thử

H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối, tº)

Hệ dung môi triển khai: n-hexan/EtOAc/MeOH (20/5/3)



Trong đó:

25



(1) Phân đoạn n-hexan



VN

U



(2) Phân đoạn DCM

(3) Phân đoạn EtOAc

(4) Cao tổng.



ac

y,



Kết quả sắc ký đồ TLC với hệ dung môi n-hexan/EtOAc/MeOH = 20/5/3,

các vết cho sự phân tách khá tốt, đặc biệt là phân đoạn DCM.



dP

ha

rm



Như vậy, sắc ký đồ TLC và kết quả chiết xuất cao phân đoạn cho thấy phân

đoạn DCM có nhiều tiềm năng nên nhóm đề tài quyết định chọn cao phân đoạn

này để tiến hành sắc ký cột phân lập các chất tinh khiết.

3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn DCM

của nấm Cổ cò.



ine



an



Cân 45 g cao phân đoạn DCM của nấm Cổ cò (DNCC) tiến hành sắc ký

cột pha thường silica gel với hệ dung môi gradient là: n-hexan:EtOAc:MeOH

(100% - 5:1:1 - 0:2:1) thu được 7 phân đoạn nhỏ ký hiệu là DNCC1-7.



ed

ic



Tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel RP-18 phân đoạn

DNCC4 (19.3 g) với hệ dung môi rửa giải Aceton:H2O (2:1 - 20:1), thu được 2

phân đoạn ký hiệu là DNCC4.1-4.2.



of



M



Phân đoạn DNCC4.2 (6.3 g) tiếp tục được tiến hành sắc ký cột pha đảo

với hệ dung môi Aceton:H2O (7:1 - 25:1) thu được 2 hợp chất ký hiệu là

NCC03 (15 mg) và NCC06 (10 mg).



ho

ol



Như vậy, bằng các kỹ thuật chiết xuất và các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng,



Co



py



rig



ht



@



Sc



sắc ký cột, đã phân lập được 2 hợp chất NCC03 và NCC06 từ phân đoạn

DNCC. Các hợp chất này cần tiến hành sắc ký đồ HPLC để kiểm tra độ tinh

khiết cần thiết sau đó mới tiến hành đo bộ phổ (NMR và MS) để xác định cấu

trúc hóa học.



26



VN

U

ac

y,

dP

ha

rm

CC: PR-18



of



M



ed

ic



ine



an



CC: PR-18



ho

ol



Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao nấm Cổ cò phân đoạn DCM



Sc



3.1.3. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết



@



Sau khi phân lập TLC để kiểm tra độ tinh sạch, tiếp tục tiến hành chạy

HPLC để xác định chính xác hơn độ tinh sạch của NCC03 và NCC06.

Các thông số kỹ thuật của chương trình chạy HPLC:



rig



ht



- Hệ thống sắc ký HPLC-DAD Shimadu

- Cột Agilent C18 (5µm, 4.5 x 250mm)



py



- Nhiệt độ lò cột: 40oC

- Thể tích tiêm: 10 µl



Co



- Tốc độ dòng: 1.0 mL/phút

- Pha động: Acetonitril (ACN) – Acid phosphoric 0.1% trong nước.

27



Chương trình HPLC cho các chất NCC03 và NCC06 là:



VN

U



- Chương trình KT ACN80: ACN 80%



NCC03



dP

ha

rm



NCC06



ac

y,



- Chương trình KT ACN100: ACN 100%



Hình 3.4. Kết quả chạy HPLC kiểm tra độ tinh khiết của 2 hợp chất

NCC03 và NCC06



an



Kết quả cho thấy:



ine



Hợp chất NCC03 phát hiện tại PDA là 243 nm, có thời gian lưu tại 16

phút và đạt độ tinh sạch là 90,336% tính theo diện tích píc.



ed

ic



Hợp chất NCC06 phát hiện tại PDA là 244 nm, có thời gian lưu tại 27,5

phút và đạt độ tinh sạch là 90,62% tính theo diện tích píc.



Biện luận cấu trúc 2 hợp chất NCC03 và NCC06



ho

ol



3.2.



of



M



Như vậy, bằng sắc ký đồ HPLC có thể thấy hai hợp chất NCC03 và

NCC06 đều khá sạch và đủ điều kiện để đo bộ phổ NMR và MS để xác định

cấu trúc hóa học.



3.2.1. Hợp chất NCC03



Sc



Hợp chất NCC03 phân lập được có dạng bột khơng màu. Nhiệt độ nóng

chảy của hợp chất trong khoảng: 168-170ºC.



ht



@



Phổ khối ESI-MS của hợp chất NCC03 cho tín hiệu píc ion tại m/z: 505,0

[M+Na]+ cho gợi ý một công thức phân tử là C32H50O3 có khối lượng tính tốn

là 482,4.



Co



py



rig



Tín hiệu trên phổ 1H-NMR của hợp chất NCC03 cho tín hiệu 8 nhóm

methyl gồm một nhóm acetoxyl tại δH 2,05; 6 tín hiệu singlet tại δH 0,57, 1,00,

0,89, 0,96, 0,88 và 1,67; 1 tín hiệu douplet tại δH 0,92 (d, J = 6,5 Hz); 3 tín hiệu

proton của 3 olefin tại δH 5,46 (1H, br s, H-7), 5,32 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-11),

5,40 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-24); 3 tín hiệu proton có độ dịch chuyển về trường

28



VN

U



thấp tại δH 4,51 (1H, dd, J = 4,5 & 11,5 Hz, H-3), 4,00 (2H, s, H-26) đặc trưng

cho các liên kết với oxy.



dP

ha

rm



ac

y,



Các tín hiệu proton này hồn tồn trùng khớp khi phân tích phổ

13

C-NMR và DEPT. Hai phổ này cho tín hiệu của 32 carbon bao gồm có 01 tín

hiệu acetyl tại δC 171,0 và 21,3; 7 tín hiệu nhóm methyl tại δC 15,7, 22,8, 28,1,

16,9, 25,6, 13,7 và 18,4; 3 cặp olefin tại δC 119,9, 142,8, 145,7, 116,6, 127,0,

134,4. Khi phân tích tương tác trực tiếp H→C trên phổ HSQC dễ dàng xác định

vị trí C3 tại δC 80.9 và tín hiệu hydromethylen tại δC 69,1.

Bằng tương tác xa H → C trên phổ HMBC cho xác định các tương tác

sau:



an



+Các tương tác của các nhóm methyl trong cấu trúc của lanostan (xem

Bảng 3.) là:



ine



H18 (δH 0,57) → C13 (δC 43,8), C14 (δC 50,4), C17 (δC 50,9)



ed

ic



H19 (δH 1,00) → C10 (δC 37,3), C9 (δC 145,7)

H21 (δH 0,92) → C17 (δC 50,9), C20 (δC 36,1), C21 (δC 18,4)



M



H28 (δH 0,89) → C3 (δC 80,9), C4 (δC 37,9), C29 (δC 16,9), C5 (δC 49,3)

H29 (δH 0,96) → C3 (δC 80,9), C4 (δC 37,9), C28 (δC 28,1), C5 (δC 49,3)



of



H30 (δH 0,88) → C14 (δC 50,4), C13 (δC 43,8), C8 (δC 142,8)



ho

ol



+ Tương tác H3 (δH 4,51) → COO (δC 171,0); cho xác định vị trí acetyl hóa

tại C3.



@



Sc



+ Tương tác H26 (δH 4,00) → C24 (δC 127,0), C25 (δC 134,4), C27 (δC

13,7) và tương tác H27 (δH 1,67) → C24 (δC 127,0), C25 (δC 134,4), C26 (δC

69,1) cho xác định vị trí hydroxy tại C26.



Co



py



rig



ht



Như vậy, bằng kết quả phân tích phổ 1D, 2D-NMR và phổ ESI-MS kết

hợp với so sánh tài liệu tham khảo [31] có thể kết luận hợp chất NCC03 là:

3β-acetoxyl- lanosta-7,9(11),24-triene-26-ol có cấu trúc như hình 3.5.



29



VN

U

ac

y,

dP

ha

rm



Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC03

(3β-acetoxyl- lanosta-7,9(11),24-triene-26-ol)

3.2.2. Hợp chất NCC06



an



Hợp chất NCC06 phân lập được có dạng bột màu trắng, nóng chảy ở

nhiệt độ: 179–181oC.



ed

ic



ine



Phổ khối ESI-MS của hợp chất NCC06 cho tín hiệu píc ion tại m/z: 441,3

[M+H]+ cho gợi ý một cơng thức phân tử là C30H48O2 có khối lượng tính toán

là 440,3.



of



M



Trên phổ 1D-NMR (1H-, 13C-NMR, DEPT) của hợp chất NCC06 cho tín

hiệu tương tự như hợp chất NCC03 chỉ khác là hợp chất này khơng có tín hiệu

nhóm acetyl.



@



Sc



ho

ol



Cụ thể là: trên phổ 1H-NMR của hợp chất NCC06 cho tín hiệu 7 nhóm

methyl gồm 6 tín hiệu singlet tại δH 0,57, 1,01, 0,88, 0,99, 0,88 và 1,67; 1 tín

hiệu douplet tại δH 0,92 (d, J = 6,5 Hz); ba tín hiệu prtoton của 3 olefin tại δH

5,47 (1H, d, J = 6,0 Hz), 5,32 (1H, d, J = 6,0 Hz), 5,40 (1H, t, J = 7,0 Hz); ba

tín hiệu proton có độ dịch chuyển về trường thấp tại δH 3,25 (1H, J = 4,5 &

11,5Hz), 4,00 (2H, s) đặc trưng cho các liên kết với oxy.



Co



py



rig



ht



Các tín hiệu proton này hồn tồn trùng khớp khi phân tích phổ

13

C-NMR và DEPT. Hai phổ này cho tín hiệu của 30 carbon bao gồm 7 tín hiệu

nhóm methyl tại δC 15,7, 22,8, 25,6, 28,1, 15,8, 13,7 và 18,4. Tín hiệu nhóm

hydroxymethin tại δC 79,0 và tín hiệu 1 nhóm hydroxymethylen tại δC 69,1. Vị

trí carbon khác được xác định dựa vào tín hiệu trên phổ thực nghiệm và gán các

vị trị khi so sánh với tài liệu tham khảo [12] về hợp chất ganodermadiol. Như

vậy, bằng kết quả phân tích các dữ liệu phổ trên có thể kết luận hợp chất NCC06

30



dP

ha

rm



ac

y,



VN

U



là lanostan 7,9(11),24-triene-3β,26-diol, còn gọi là ganodermadiol, có cơng

thức như hình 3.6.



Hình 3.6 Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC06



an



(lanostan-7,9(11),24-triene-3β,26-diol, ganodermadiol)

Bảng 3. Dữ liệu phổ của 2 hợp chất NCC03 và NCC06

13



STT



1



H-NMR



35,4



2



24,6



-



@



5,46 (1H, brs)



ht



8



Sc



6



9



rig



of



4



80,9



ho

ol



3



4,51 (1H, dd,

4,5, 11,5)



7



CNMRa

[31]



NCC06 (500MHz, CDCl3)

13



CNMRa



CNMRb

[12]



35,4



35,7



35,8



24,3



24,6



28,2



79,0



79,0



M



1



5



HMBC



H3→C28,

C29, C4,

OAc



80,9



13



1



H-NMR



3,25(1H,

4,5, 11,5Hz)



37,9



37,6



38,7



38,7



49,3



49,3



49,1



50,4



22,8



22,8



23,0



23,3



119,9



119,9



120,2



120,3



142,8



142,8



142,7



142,7



145,7



145,7



146,0



145,9



37,4



37,9



116,3



116,3



5,47 (1H, d,

6Hz)



10



-



37,3



37,2



11



5,32 (1H, d,

6,0)



116,6



116,6



37,6



37,9



37,9



37,9



43,8



43,8



43,8



43,8



py

Co



CNMRa



ed

ic



13



ine



NCC03 (500MHz, CDCl3)



12

13



-



5,32 (1H, d,

6,0Hz)



31



50,4



50,3



49,2



15



31,5



31,5



31,5



28,0



16



27,9



27,9



28,0



31,5



17



50,9



50,9



50,9



50,9



0,57 (3H, s)



15,7



15,7



H18→C13

, C14, C17



15,7



15,7



1,00 (3H, s)



22,8

36,1



22,8

36,1



H19→C10

, C9



18,4



H21→

C17, C20,



19

20

21



0,92 (3H, d,

6,5)



18,4



C21



22



35,9



35,9



23



24,3



24,6



0,57 (3H, s)



ac

y,



18



VN

U



50,4



1,01(3H, s)



22,8

36,1



22,8

36,1



18,4



18,4



36,0



36,0



24,6



24,6



5,40 (1H, t,

7,0Hz)



127,0



127,0



dP

ha

rm



-



an



14



0,92 (3H, d,

6,5)



24



5,40 (1H, t,

7,0Hz)



127,0



127,0



25



-



134,4



134,4



-



134,4



134,3



26



4,00 (2H, s)



69,1



69,1



4,00 (2H, s)



69,1



69,1



27



1,67 (3H, s)



13,7



H27→C25

, C26, C24



1,67 (3H, s)



13,7



13,6



28



0,89 (3H, s)



28,1



28,1



H28→C3



0,88 (3H, s)



25,6



25,6



29



0,96 (3H, s)



16,9



16,9



H29→C3



0,99 (3H, s)



28,1



27,8



25,6



25,5



H30→C14

, C13, C8



0,88 (3H, s)



15,8



15,8



a)



: (125MHz, CDCl3);



b)



ine



ed

ic



: (50 MHz, CDCl3)



Bàn luận



Sc



3.3.



13,7



M



ho

ol



0,88 (3H, s)



of



30



H24→C25



@



3.3.1. Về chiết xuất



py



rig



ht



Đề tài sử dụng phương pháp chiết nóng dược liệu khô được nghiền nhỏ

để thu được lượng cao tổng nhanh và lớn nhất. Ở nhiệt độ cao sự khuếch tán

các chất trong dược liệu diễn ra nhanh và triệt để hơn. Hơn thế nữa dung môi

MeOH dễ kiếm, rẻ tiền, được coi là dung mơi đa năng hòa tan nhiều nhóm chất

trong dược liệu.



Co



Đề tài sử dụng phương pháp lỏng - lỏng với dicloromethan vì: dung mơi

dicloromethan là dung mơi có độ phân cực trung bình yếu có thể hòa tan tốt

32



VN

U



nhóm chất steroid và triterpen. Hai nhóm chất này đều rất đặc trưng cho chi

Ganoderma. Thực tế thí nghiệm cũng cho thấy lượng cao phân đoạn

dicloromethan cũng cao nhất.

3.3.2. Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc hợp chất.



dP

ha

rm



ac

y,



Bằng các phương pháp sắc ký cột (CC) pha thường và pha đảo, đề tài đã

phân lập được 2 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn DCM của dịch chiết nấm Cổ

cò. Đây là 2 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài G.flexipes.

Sử dụng các phương pháp thường quy trong nhận dạng cấu trúc: đặc tính

lý hóa, các phổ cộng hưởng từ hạt nhân đã xác định được cấu trúc của 2 hợp

chất trên.



ine



an



Hợp chất NCC03: từ kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân và so sánh

với tài liệu tham khảo [31] xác định được NCC03 có cấu trúc lanostan triterpen:

3β-acetoxyl- lanosta-7,9(11),24-triene-26-ol.



ed

ic



Hợp chất NCC06: cũng thuộc nhóm cấu trúc lanostan triterpen:

lanostan-7,9(11),24-triene-3β,26-diol, chính là ganodermadiol. Hợp chất này

trước đó đã được phân lập từ G.lucidum, G.pfeifferi [34], G.curtisii [26].



of



M



Hoạt tính sinh học của hợp chất NCC06 (lanostan-7,9(11),24-trien3β,26-diol)



py



rig



ht



@



Sc



ho

ol



Năm 2003, Mothana R. A. A [34] phân lập được hợp chất NCC06 từ lồi

Ganoderma pfeifferi và thử hoạt tính kháng virut của các hợp chất lanostan

triterpen. Bằng phương pháp nhuộm tế bào, các tác giả đã xác định được hợp

chất ganodermadiol có hoạt tính bảo vệ tế bào Vero chống lại virut HSV type

1 với giá trị ED50 0,068 mmol/l và tế bào MDCK chống lại virut cúm A với giá

trị lớn hơn 0,22 mmol/L. Trong một nghiên cứu khác của Jiao Y và cộng sự

[26] đã phân lập được hợp chất này từ loài Ganoderma curtisii và xác định hoạt

tính ức chế sản sinh NO trên tế bào tiểu thần kinh đệm gây bởi LPS với giá trị

IC50 13,72 ± 0,61 µM (sử dụng quercetin làm chứng với IC50 là 15,13 ± 0,62

µM).



Co



Như vậy, việc phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất đã góp

phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của lồi G.flexipes và bổ sung thêm các

dữ liệu về chi Ganoderma. Đồng thời kết quả này trở thành cơ sở khoa học đầu

33



Co



py



rig



ht



@



Sc



ho

ol



of



M



ed

ic



ine



an



dP

ha

rm



ac

y,



VN

U



tiên, định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học, tác dụng

sinh học cũng như việc sử dụng của loài nấm dược liệu này.



34



KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ



VN

U



1. Kết luận



Đã phân lập được hai hợp chất tinh khiết là NCC03 (15 mg) và NCC06

(10 mg).



dP

ha

rm



ac

y,



Xác định được hợp chất NCC03, NCC06 lần lượt là :3β-acetoxyllanosta-7,9(11),24-triene-26-ol



lanostan-7,9(11),24-triene-3β,26-diol

(ganodermadiol).

2. Kiến nghị



Kết quả của đề tài mới chỉ dừng lại ở phân lập, xác định được 2 hợp chất

lanostan triterpen từ phân đoạn DCM của nấm Cổ cò.



ine



an



Do đó, nhóm nghiên cứu kiến nghị tiếp tục thực hiện các nghiên cứu về:

Thành phần hóa học bao gồm định tính, phân lập, định lượng. Từ đó xây

dựng tiêu chuẩn dược liệu, cao dược liệu của loài.



Co



py



rig



ht



@



Sc



ho

ol



of



M



ed

ic



Tác dụng sinh học của loài, làm cơ sở cho việc sử dụng loài nấm quý này

trong lâm sàng.



35



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×