Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Biểu đồ 3.11: Mối tương quan giữa tỷ lệ hình thái bình thường với chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh ở mẫu lọc rửa mini thang nồng độ không liên tục (n= 30).

Biểu đồ 3.11: Mối tương quan giữa tỷ lệ hình thái bình thường với chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh ở mẫu lọc rửa mini thang nồng độ không liên tục (n= 30).

Tải bản đầy đủ - 0trang

44



được lọc rửa đơn thuần và thang nồng độ.

3.4.1. So sánh chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu mẫu tươi với

mẫu được lọc rửa đơn thuần và thang nồng độ.

Bảng 3.8. So sánh mật độ và tỷ lệ sống tinh trùng trước và sau bảo quản lạnh

(n= 30).

Tươi

Trước



Chỉ số



Sau BQL



BQL

Mật độ

(triệu/ml)



(X ± SD)



Tỷ lệ sống

(%)



(X ± SD)



13,6  1,9



P



Rửa đơn thuần



13,6  2,2



> 0,05



P



Sau BQL



BQL

14,3  2,8



13,4  1,9



Trước



13,2



< 0,05



76,4  7,8



Sau BQL



BQL

5,9  2,1



> 0,05

41,8 



75,4  8,2



Trước



Thang nồng độ



5,9  2,2



> 0,05

38,9 



81,7 



13,5



8,4



< 0,05



21,8  9,9

< 0,05



Mật độ tinh trùng sau bảo quản lạnh ở cả 3 nhóm đều được thu hồi tối

đa, khơng có sự khác biệt (p> 0,05). Tỷ lệ sống giảm rõ rệt sau bảo quản lạnh,

đặc biệt ở nhóm được lọc rửa bằng phương pháp thang nồng độ (p< 0,05).

Bảng 3.9. So sánh tỷ lệ (%) di động tiến tới và tổng số tinh trùng di động

(triệu/ml) trước và sau bảo quản lạnh (n= 30)

Tươi

Chỉ số



Di động

tiến tới (%)

Tổng di

động tiến

tới

(triệu/ml)



(X ± SD)



Trước



Sau



Rửa đơn thuần

Trước

Sau



BQL



BQL



BQL



29,4 



14,2 



6,3



7,3



P

(X ± SD)



< 0,05

1,98 



1,2



1,1

< 0,05



BQL



BQL



10,4 



39,8 



5,7



8,0



< 0,05



4,03 



P



31,2  6,5



Thang nồng độ

Trước

Sau



4,5  1,3



1,4  0,8



< 0,05



BQL

4,9  5,0



< 0,05

2,5  1,2



0,3  0,4



< 0,05



Tỷ lệ di động tiến tới và tổng số tinh trùng di động tiến tới sau bảo quản

lạnh giảm hơn ½ so với trước khi bảo quản trên cả 3 nhóm. Sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê (p < 0,05).



45



Bảng 3.10. So sánh chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu của

những mẫu tinh dịch thiểu tinh được lọc rửa đơn thuần và thang nồng độ

(n= 30).

Tươi (I)

(X ± SD)



Rửa đơn thuần



Thang nồng độ



(II)



(III)



(X ± SD)



(X ± SD)



PI,II,III

PI,II> 0,05



Tỷ lệ sống

(%)



55,6  17,6



51,3  18,4



27,5  12,9



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05

PI,II< 0,05



CSF di

động tiến



48,2 21,3



34,7  18,4



12,4  13,1



tới (%)



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05

PI,II< 0,05



CSF di

động (%)



54,7  28,6



43,6  18,1



20,3  13,3



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05



Tổng di

động tiến

tới



PI,II< 0,05

1,98  1,1



1,4  0,8



0,3  0,4



(triệu/ml)



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05



Chỉ số CSF di động, CSF di động tiến tới sau 30 ngày bảo quản ở mẫu

tươi cao hơn so với mẫu rửa đơn thuần cũng như nhóm được lọc rửa theo

thang nồng độ. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p< 0,05. Tỷ lệ tinh

trùng sống ở mẫu tươi và rửa đơn thuần cũng cao hơn so với mẫu được lọc rửa

thang nồng độ. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p< 0,05.

Trong 30 mẫu nghiên cứu của chúng tơi có 14 mẫu tinh dịch thiểu tinh

có di động tiến tới bình thường (PR 32%) chiếm 46,7% và 16 mẫu tinh dịch

thiểu tinh kèm nhược tinh (PR< 32%) chiếm 53,3%. Chất lượng tinh trùng



46



sau bảo quản lạnh sâu được đánh giá theo các chỉ số CSF di động, CSF di

động tiến tới, tỷ lệ tinh trùng sống đối với:

 14 mẫu thiểu tinh có di động tiến tới bình thường.

 16 mẫu thiểu tinh kèm nhược tinh.

Kết quả so sánh những chỉ số này trên các mẫu tươi và mẫu được rửa

đơn thuần và thang nồng độ sau bảo quản lạnh, được thể hiện trong các bảng

3.11 và 3.12.

3.4.2. So sánh chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh ở những mẫu tươi

với mẫu được lọc rửa đơn thuần và thang nồng độ ở nhóm thiểu tinh với

di động bình thường

Bảng 3.11: So sánh chỉ số chất lượng tinh trùng (%) sau bảo quản lạnh

giữa mẫu tươi với mẫu được lọc rửa đơn thuần và thang nồng độ ở nhóm

thiểu tinh với di động bình thường (n= 14).

Tươi (I)

(X ± SD)

Tỷ lệ sống



58,4 



(%)



14,5



CSF di động



51,0 



tiến tới (%)



24,6



CSF di động



56,0 



(%)



22,0



Rửa đơn thuần



Thang nồng độ



(II)



(III)



(X ± SD)



(X ± SD)

PI,II> 0,05



48,7  19,95



30,3  11,8



tới

(triệu/ml)



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05

PI,II< 0,05



26,3  15,9



15,5  13,1



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05

PI,II< 0,05



34,9  15,6



23,9  12,4



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05



Tổng di

động tiến



PI,II,III



PI,II< 0,05

2,4  1,2



1,4  0,9



0,5  0,4



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05



Chỉ số CSF di động, CSF di động tiến tới sau 30 ngày bảo quản ở mẫu

tươi cao hơn so với mẫu rửa đơn thuần cũng như nhóm được lọc rửa theo

thang nồng độ ở nhóm thiểu tinh với di động bình thường. Sự khác biệt này



47



có ý nghĩa thống kê với p< 0,05. Tỷ lệ tinh trùng sống ở mẫu tươi và rửa đơn

thuần cũng cao hơn so với mẫu được lọc rửa thang nồng độ. Sự khác biệt này

có ý nghĩa thống kê với p< 0,05.

3.4.3. So sánh chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh ở những mẫu

tươi với mẫu được lọc rửa đơn thuần và thang nồng độ ở nhóm thiểunhược tinh.

Bảng 3.12: So sánh chỉ số chất lượng tinh trùng (%) sau bảo quản lạnh

giữa mẫu tươi với mẫu được lọc rửa đơn thuần và thang nồng độ ở nhóm

thiểu- nhược tinh (n= 16)

Tươi (I)

(X ± SD)

Tỷ lệ sống



53,1 



(%)



19,3



Rửa đơn thuần



Thang nồng độ



(II)



(III)



(X ± SD)



(X ± SD)



PI,II,III

PI,II> 0,05



53,5  17,3



24,3  13,7



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05



CSF di động



45,8 



tiến tới (%)



18,4



PI,II> 0,05

42,1  17,7



9,6  12,97



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05



CSF di động



53,6 



(%)



15,8



PI,II> 0,05

51,2  17,02



17,03  13,5



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05



Tổng di

động tiến

tới

(triệu/ml)



PI,II> 0,05

1,6  0,97



1,5  0,8



0,2  0,4



PI,III< 0,05

PII,III< 0,05



Chỉ số CSF di động, CSF di động tiến tới, tỷ lệ sống sau 30 ngày bảo

quản ở mẫu tươi tương đương với mẫu rửa đơn thuần ở nhóm thiểu- nhược

tinh (p> 0,05). Chỉ số CSF di động, CSF di động tiến tới, tỷ lệ sống ở những

mẫu tươi và mẫu rửa đơn thuần cao hơn so với mẫu được lọc rửa bằng thang



48



nồng độ. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê khi kiểm định trung bình T-test

với p < 0,05.



49



CHƯƠNG 4

BÀN LUẬN

4.1. Về quy trình lọc rửa và bảo quản lạnh sâu

4.1.1. Lọc rửa tinh trùng trong bảo quản lạnh.

Lọc rửa tinh trùng là phương pháp chọn lọc tinh trùng có khả năng thụ

tinh cao nhất, cơ đặc những tinh trùng có di động tốt và hình dạng bình

thường trong một thể tích nhỏ, loại bỏ tinh trùng chết, các tế bào khác như

bạch cầu và vi khuẩn, loại được độc chất và những chất sinh học bất lợi như

các yếu tố bất hoạt hoặc các gốc oxy hoạt động trong tinh dịch. Tuy theo chất

lượng tinh ban đầu mà có nhiều cách phương pháp xử lý tinh dịch trước khi

bảo quản. Nhìn chung việc phân lập và lựa chọn tinh trùng có thể thực hiện

dựa trên 3 kỹ thuật chính: rửa đơn thuần (Simple washing), sự di chuyển của

tinh trùng (Sperm migration) và thang nồng độ (Gradient). Ứng dụng việc lọc

rửa tinh trùng trong chuẩn bị tinh trùng cho lĩnh vực hỗ trợ sinh sản rất có

hiệu quả. Tuy nhiên, hiệu quả của phương pháp bảo quản lạnh mẫu tinh trùng

đã được lọc rửa vẫn còn nhiều tranh luận, chưa có sự thống nhất giữa các tác

giả trong và ngoài nước.

Theo Donnelly Eilish (2001), Saritha K.R (2001), Nguyễn Phương

Thảo Tiên (2007), Phạm Thị Thu Thủy (2011) tinh trùng tươi đơng lạnh có đề

kháng tốt hơn với shock lạnh so với tinh trùng đã được lọc rửa và chất lượng

của mẫu tinh trùng trước bảo quản lạnh tốt thì chất lượng tinh trùng sau ra

đông sẽ tốt hơn. Tỷ lệ di động tiến tới sau rã đông ở những mẫu tinh trùng đã

được chuẩn bị bằng thang nồng độ Percoll, hoặc bơi lên thấp hơn có ý nghĩa

thống kê so với mẫu tinh trùng tươi, khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê giữa lọc rửa bơi lên và thang nồng độ Percoll. Sự nguyên vẹn của DNA sau

rã đông ở mẫu tinh trùng tươi cao hơn có ý nghĩa thống kê so với mẫu tinh



50



trùng đã được lọc rửa [27], [32], [50], [60]. Trái với các kết quả trên, Esteves

S.C (2000) đã nghiên cứu “Sự cải thiện các đặc tính di động và tình trạng cực

đầu của tinh trùng sau bảo quản lạnh ở những mẫu tinh trùng đã được lọc rửa”

cho thấy: mẫu tinh trùng bảo quản lạnh được chuẩn bị bằng lọc rửa bơi lên,

sau khi rã đơng thì khả năng di động và sự nguyên vẹn cực đầu tốt hơn [61].

Tương tự, Petyim và cộng sự (2014) sau khi nghiên cứu kết luận rằng, chuẩn

bị tinh trùng bằng phương pháp bơi lên trước khi trữ đông đem lại chất lượng

tinh trùng tốt hơn và ít lượng tinh trùng chết theo chương trình hơn so với

chuẩn bị tinh trùng cũng bằng phương pháp bơi lên nhưng sau khi rã đơng.

Do đó, chuẩn bị tinh trùng trước bảo quản lạnh có thể được xem xét thường

quy với bảo quản lạnh tinh trùng [49].

Theo khuyến cáo của WHO, đối với mẫu tinh dịch chất lượng kém, lọc

rửa tinh trùng bằng phương pháp ly tâm thang nồng độ hoặc rửa đơn thuần sẽ

được ưu tiên sử dụng hơn so với phương pháp bơi lên do phương pháp này

giúp thu được tinh trùng có mật độ cao hơn [3]. Phương pháp lọc rửa đơn

thuần (Simple Washing Technique) được xem xét sử dụng khi tình trạng mẫu

tinh trùng có q ít số lượng tinh trùng, trong khi có thể phát sinh sự mất mát

nhiều số lượng tinh trùng di động khi áp dụng các phương pháp khác. Trong

phương pháp này, sau khi hóa lỏng hồn tồn, mơi trường ni cấy được thêm

vào trong tinh dịch rồi đem ly tâm để loại bỏ tinh tương. Phương pháp này sử

dụng một lực ly tâm thấp (nhỏ hơn 500g) và các bước ly tâm ít hơn để giảm

thiểu tối đa tổn thương gây ra bởi sự hình thành các gốc tự do (ROS) do các

bạch cầu, tinh trùng bất thường. Đồng thời rửa đơn thuần cũng không sử dụng

mơi trường lọc, do trong mơi trường lọc có chứa các hạt lọc có thể gây tổn

thương tinh trùng thậm chí gây độc cho tinh trùng, gây ảnh hưởng xấu đến sự

toàn vẹn DNA của tinh trùng [56].



51



Năm 1994, Mortimer D đã cải tiến phương pháp ly tâm thang nồng độ

thành phương pháp mini thang nồng độ dung cho các mẫu tinh dịch thiểu tinh,

nhược tinh nặng hoặc mẫu tinh dịch kết hợp thiểu- nhược- quái tinh [62].

Theo Counsel M và cộng sự (2004): phương pháp lọc rửa bằng thang nồng độ

Percoll làm tăng rõ rệt khả năng sống của tinh trùng sau rã đông ở mẫu thiểu

tinh (p < 0,01), đồng thời phương pháp này cũng giúp thu được tổng số tinh

trùng di động cao hơn so với phương pháp bơi lên [56].

Nghiên cứu này được tiến hành trên các mẫu thiểu tinh nên chúng tôi lựa

chọn phương pháp mini thang nồng độ và rửa đơn thuần để lọc rửa tinh trùng.

Sau lọc rửa, mật độ tinh trùng giảm đáng kể, tuy nhiên chất lượng của các

mẫu thiểu tinh được cải thiện rõ rệt. Sự khác biệt của các thông số sau lọc rửa

đều rất đáng tin cậy và có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Bảng 3.4). Như vậy,

việc lọc rửa tinh trùng không những có hiệu quả trên các mẫu tinh trùng bình

thường như một số tác giả đã nghiên cứu mà quá trình này còn mang lại hiệu

quả rõ nét khi tiến hành trên các mẫu tinh dịch chất lượng kém [56].

4.1.2. Bảo quản lạnh tinh trùng.

4.1.2.1. Chất bảo quản lạnh.

Trong quá trình tiến hành bảo quản lạnh tinh trùng, để hạn chế những tổn

thương, nhất là khả năng di động kém sau rã đông của tinh trùng, các nhà

nghiên cứucứu sử dụng thêm các chất bảo quản lạnh (CPA). Hai dạng CPA

thường hay dùng trong đơng lạnh là CPA có khả năng thẩm thấu qua màng tế

bào và CPA khơng có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào (những chất có

phân tử lượng lớn, thường gặp là sucrose hay các oligosaccharide). Hai loại

CPA này có tính chất và cách hoạt động khác nhau, nhưng hỗ trợ nhau trong

vai trò là tác nhân khử nước bên trong tế bào, giúp hạn chế sự tạo thành tinh

thể đá nội bào [63]. Nhiều tác giả đã sử dụng nhiều loại môi trường khác nhau

để bảo quản tinh trùng. Ban đầu, các tác giả sử dụng glycerol đơn thuần để



52



làm môi trường bảo quản lạnh. Các tác giả đã khuyến cáo việc sử dụng môi

trường phối hợp sẽ cho chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh tốt hơn

glycerol đơn thuần và TEST - Yolk là môi trường nên được lựa chọn trước tiên

để bảo quản tinh trùng [64]. Theo Trịnh Sinh Tiên (2002) sử dụng môi trường

GEYC và môi trường Sperm Freeze cho chất lượng tinh trùng sau bảo quản

lạnh là tương đương [65]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng môi

trường bảo quản lạnh là Sperm Freeze, là một loại CPA phối hợp.

Khi pha môi trường bảo quản lạnh vào tinh dịch phải đảm bảo đúng tỷ lệ

0,7 ml môi trường bảo quản/ 1ml tinh dịch, thao tác nhẹ nhàng để đảm bảo

tinh trùng ít bị tác động bởi mơi trường, bằng cách nhỏ từ từ từng giọt với tốc

độ 5 giây/1giọt vào mẫu tinh dịch và lắc đều. Sau đó để mẫu cân bằng 10 phút

ở nhiệt độ phòng trước khi bảo quản lạnh. Mẫu không được đặt trong tủ ấm vì

nhiệt độ càng cao, tính độc của glycerol với tế bào càng tăng. Thời gian này

có tác dụng để glycerol trong môi trường ngoại bào trao đổi nước qua màng tế

bào với mơi trường nội bào [66].

4.1.2.2. Đóng gói và hạ nhiệt độ.

Có hai hình thức đóng gói hay được sử dụng là cọng rạ (straw) bằng

nhựa 0,25 ml, 0,5 ml hoặc tuýp chịu lạnh (cryovial) 1- 3 ml. Hình thức đóng

gói bằng tp chịu lạnh cryovial thích hợp hơn đối với quy trình hạ nhiệt

chậm và cho chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh tốt hơn so với hình thức

đóng gói bằng cọng rạ [67]. Trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng cryovial

1,8 ml vì nó thích hợp với thể tích mẫu tinh dịch của nghiên cứu. Mỗi mẫu

tinh dịch được chia 3 phần cho mẫu đã được rửa đơn thuần, mẫu được lọc rửa

theo phương pháp thang nồng độ và mẫu tươi không lọc rửa. Việc phân chia

mẫu như vậy đảm bảo tính hợp lý, thống nhất và chính xác của nghiên cứu.



53



Hiện có 2 phương pháp được áp dụng trong bảo quản lạnh tinh trùng là

hạ nhiệt độ chậm và thủy tinh hóa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng

phương pháp hạ nhiệt độ bằng máy lạnh bán tự động Nicool-10 đảm bảo tốc

độ hạ nhiệt độ:

- 5 phút: hạ từ nhiệt độ thường đến -10°C

- 5 phút: hạ nhiệt độ -10°C đến -80°C

- 10 phút: hạ nhiệt độ -80°C đến -120°C

- 5 phút: hạ nhiệt độ -120°C đến -196°C

Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp hạ nhiệt sử dụng máy Nicool

10 là số lượng tuýp chứa mẫu trong mỗi quy trình rất hạn chế (10 tuýp), lượng

nitơ tiêu thụ trong mỗi quy trình khá lớn (gần 1000ml) và đòi hỏi phải có thiết bị

máy móc chun dụng, khá đắt tiền, tính cơ động của phương pháp không cao.

4.1.2.3. Lưu trữ.

Theo Saritha và cộng sự (2001), chất lượng tinh trùng sau bảo quản

khơng có sự khác biệt khi bảo quản trong môi trường nitơ lỏng và trong hơi

nitơ lỏng [50]. Tuy nhiên, để đảm bảo sự thống nhất trong nghiên cứu, chúng

tôi lưu trữ tinh trùng trong nitơ lỏng, là phương pháp đang được sử dụng phổ

biến hiện nay ở trong nước và trên thế giới. Trong suốt q trình bảo quản

lạnh, mẫu ln chìm trong nitơ lỏng để đảm bảo nhiệt độ của mẫu bảo quản

được duy trì hằng định ở -1960C. Do điều kiện thời gian thực hiện đề tài, các

mẫu lưu trữ trong nghiên cứu của chúng tôi là 30 ngày. Khoảng thời gian này

phù hợp với chu kỳ kinh nguyệt của người phụ nữ để làm HTSS lần 2 nếu lần

1 thất bại.

4.1.3. Rã đông

Các tác giả đưa ra các phương pháp tan đông khác nhau, theo Vladimir

Isasachenko (2004) tốc độ tan đơng chậm có thể ảnh hưởng lên chất lượng

tinh trùng, quá trình này làm tăng thêm các tế bào tổn thương [68]. Tác giả



54



Isachenco E. (2003) cũng cho rằng q trình tan đơng với tốc độ rất nhanh sẽ

giúp ngăn chặnặn sự kết tinh trở lại của các tinh thể đá, do đó sẽ ít gây hại với

tế bào [69]. Theo Sherman J.K, tốc độ tan đông tốt nhất từ 1- 600C/ phút [64].

Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi thực hiện phương pháp tan đông

bằng cách lấy mẫu trong nitơ lỏng ra và đặt ngay vào cốc nước ấm 37oC trong

10 phút. Như vậy tốc độ tan đông là 23,30C/ phút. Sau khi mẫu tinh dịch hóa

lỏng hồn tồn sẽ được loại bỏ mơi trường bảo quản lạnh bằng cách thêm từ

từ 1,5 ml Ferticult Flushing (5 giây/ 1giọt), ly tâm 1500 vòng/phút trong 5

phút, hút bỏ dịch nổi để lại 1ml tinh dịch và đánh giá sau rã đông. Việc loại bỏ

chất bảo quản lạnh sau rã đơng giúp đánh giá chính xác chất lượng tinh dịch

sau rã đông đồng thời hạn chế thời gian tinh trùng tiếp xúc lâu với chất bảo

quản (chất gây độc với tế bào).

4.2. Chất lượng tinh trùng ở những mẫu tinh dịch thiểu tinh sau lọc rửa

đơn thuần và thang nồng độ không liên tục.

Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng kỹ thuật lọc rửa tinh trùng bằng

phương pháp ly tâm dựa vào mini thang nồng độ và rửa đơn thuần do mẫu

nghiên cứu của chúng tôi là mẫu thiểu tinh nên lựa chọn phương pháp này sẽ

cho kết quả tốt hơn so với phương pháp bơi lên và ly tâm thang nồng độ thông

thường [3].

Sau khi lọc rửa bằng phương pháp ly tâm theo mini thang nồng độ chúng

tơi thu hồi được tinh trùng có chất lượng tinh trùng tốt hơn so với trước lọc

rửa (xem bảng 3.4, 3.5, 3.6 và biểu đồ 3.2). Nguyên lý của phương pháp

thang nồng độ là dựa trên tỉ trọng, sau ly tâm tất cả tinh tương, tinh trùng chết,

tinh trùng bất thường, vi khuẩn và những thành khác có trong tinh dịch sẽ

được giữ lại theo từng lớp lọc có nồng độ khác nhau, chỉ có những tinh trùng

trưởng thành (do sự cô đặc của DNA làm tỷ trọng chúng nặng hơn (1,1 g/mL)

so với tinh trùng chưa trưởng thành, hình thái bất thường lần lượt là 1,06 và



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Biểu đồ 3.11: Mối tương quan giữa tỷ lệ hình thái bình thường với chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh ở mẫu lọc rửa mini thang nồng độ không liên tục (n= 30).

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×