Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Kết quả phân loại từ mẫu san hô mềm thu từ chuyến khảo sát tại Bắc Hồng Vàn ở quần đảo Cô Tô đã xác định được 1 loài san hô mềm thuộc họ Plexauridae là loài Menella woodin (Hình 3.2).

Kết quả phân loại từ mẫu san hô mềm thu từ chuyến khảo sát tại Bắc Hồng Vàn ở quần đảo Cô Tô đã xác định được 1 loài san hô mềm thuộc họ Plexauridae là loài Menella woodin (Hình 3.2).

Tải bản đầy đủ - 0trang

8

bột mịn và loại cơ bản thành phần muối vô cơ. Lấy 100 g bột khô của 2 mẫu san hô

mềm tiến hành tạo dịch chiết phục vụ sàng lọc hoạt tính sinh học

3.2. Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào mẫu dịch chiết thô

Bảng 3.1. Kết quả xác định giá trị IC50 mẫu MW

Giá trị IC50

Dòng tế

bào



MW



Ellipticin

e



SKLU-



HepG



1

15,5



2



5

±

2,53

0,45



MCF



LNCa



KB

14,1



7



P



12,50



8



13,15



±



±



±



1,59

0,52



1,62

0,47



1.85

0,42



SKMel



NIH/3T



HL60



2



3



17,42



10,03



11,31



16,11



±



±



±



±



2,06

0,38



1,95

0,46



1,65

0,39



2,06

0,38



±



±



±



±



±



±



±



±



0,02



0,08



0,09



0,02



0,07



0,03



0,05



0,02



Từ kết quả trên, có thể nhận thấy rằng mẫu san hơ mềm Menella woodrin có

hoạt tính diệt tế bào ung thư thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau ở mức khá. Mẫu cặn

chiết MeOH của MW đã ức chế được hơn 50% sự phát triển của các dòng tế bào ung

thư thử nghiệm và tiếp tục xác định giá trị IC 50 của mẫu dịch chiết, kết quả cho thấy

mẫu MW có hoạt tính ở mức tương đối tốt với giá trị IC 50 = 10,03 - 17,42 µg/ml (Bảng

3.1). Do vậy, mẫu dịch chiết được sử dụng để phân lập, tìm kiếm hoạt chất tiềm năng.

3.3. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ lồi san hơ

mềm Menella woodin

Bằng cách kết hơp các phương pháp sắc ký kết hợp, chúng tôi đã phân lập và xác định

cấu trúc được 17 hợp chất từ lồi san hơ mềm Menella woodin chia thành 2 lớp chất là

steroid và sesquiterpenoid bao gồm:

- 07 Steroid (MW1, MW2, MW3, MW4, MW5, MW6, MW7)

- 10 Sesquiterpenoid (MW8, MW9, MW10, MW11, MW12, MW13, MW14, MW15,

MW16, MW17)

Trong đó có 8 chất mới: MW1, MW2, MW3, MW4, MW8, MW9, MW10, MW11

(Hình 3.3)



9



MW1 (chất mới)



MW8 (chất mới)



MW7

MW2, MW3, MW4

(chất mới)



MW9 (chất mới)



MW13



MW14



MW12



MW10 (chất mới)



MW11 (chất mới)



MW15



MW16

MW17

Hình 3.3. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được từ loài Menella woodin

3.4. Thông số vật lý của các hợp chất phân lập được

3.4.1. Hợp chất MW1 (Menellsteroid E): 1β,3β,5α,11β-Tetrahydroxycholestan-6-one

(chất mới)

Chất bột màu trắng, [α]D27 -4,0 (c 0,10, MeOH); (+) ESI-MS m/z: 473 [M+Na]+,

455 [M+Na-H2O]+, 437 [M+Na-2H2O]+, 413, 397, 374, 301, 149; phổ khối lượng phân

giải cao HR-ESI-MS m/z 473.3237 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức

C22H46O5Na: m/z 473,3232). CTPT: C27H46O5, M = 450

3.4.2. Hợp chất MW2 (Menellsteroid F): Cholest-24-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol (chất

mới)

Chất bột màu trắng, [α]D27 +12,0 (c 0,05, MeOH); (+) ESI-MS m/z: 457

[M+Na]+, 413, 399, 381, 363, 301, 261, 219; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS

m/z 457,3299 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức C 27H46O4Na: 457,3288).

CTPT: C27H46O4, M = 434.



10

3.4.3. Hợp chất MW3 (Menellsteroid G): 24-methylcholest-24(28)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol (chất mới)

Chất bột màu trắng, [α]D27 +4,0 (c 0,15, MeOH); (+) ESI-MS m/z: 471 [M+Na]

+



, 457, 441, 408, 360, 338, 301, 250; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS m/z:



471,3450 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C 28H48O4Na, 471,3450); CTPT:

C28H48O4, M = 448.

3.4.4. Hợp chất MW4 (Menellsteroid H): 24-Norcholest-22(E)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol (chất mới)

Chất bột màu trắng, [α]D27 +5,8 (c 0,12, MeOH); phổ khối lượng phân giải cao

HR-ESI-MS m/z: 443,3124 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức C26H44O4Cl

443,3137). CTPT: C26H44O4, M = 420.

3.4.5. Hợp chất MW5: cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol

Chất bột màu trắng, [α]D27 -11,3 (c 0,35, MeOH); phổ khối lượng phân giải cao

HR-ESI-MS m/z: 435,3319 [M-H]- (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C 27H47O4

435,3317); CTPT: C27H48O4, M = 436.

3.4.6. Hợp chất MW6: Menellsteroid B

Chất bột màu trắng, [α]D27 -18,5 (c 0,12, MeOH); ESI-MS m/z: 459 [M+Na]+,

phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS m/z: 437,3552 [M+H] + (tính tốn lý thuyết

cho cơng thức C27H49O4: 437,3553); CTPT: C27H46O4, M = 434.

3.4.7. Hợp chất MW7: (22E,24S)-24-methyl-5α-cholesta-7,22-diene-3β,5,6β,9-tetraol

Chất bột màu trắng, CTPT: C28H46O4, M = 446.

3.4.8. Hợp chất MW8: (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7-trien-12,8olide (chất mới)

Chất dầu không màu, [α]D26 +217,3 (c 0,15, CHCl3); phổ khối lượng phân giải

cao HR-ESI-MS tại m/z 283,0938 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức

C15H16O4Na+: 283,0941) CTPT: C15H16O4, M = 260.

3.4.9. Hợp chất MW9: (1R,2S,8S,10R)-1,2-dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,5,7-trien12,8-olide (chất mới)

Chất dầu không màu, [α]D26 +217,3 (c 0,15, CHCl3); phổ khối lượng phân giải

cao HR-ESI-MS tại 315,1202 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức C 16H20O5Na+:

315,1205); CTPT: C16H20O5, M = 292.

3.4.10. Hợp chất MW10: Menelloide F (chất mới)

Chất dầu không màu, [α]D26 +76,0 (c 0,10, CD3OD); UV (MeOH) λmax (log

ε) 221 (3,60) nm; CD (c 2,3 × 10-3 M, MeOH): λmax ([θ]): 204 (+17086), 226 (−12304)



11

và 249 (+12087) nm. Phổ khối lượng phân giải cao (+)-HR-ESI-MS m/z 285,1098

[M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C 15H18O4Na+: 285,1097) và (−)-HR-ESIMS m/z 297,0911 [M+Cl]- (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C15H18O4Cl: 297,0899).

3.4.11. Hợp chất MW11: Menelloide G (chất mới)

Chất dạng bột màu trắng, [α] D26 +18,0 (c 0,20, CDCl3); UV (MeOH) λmax

(log ε) 216 (3,69) nm. CD (c 1,2 × 10-3 M, MeOH) λmax ([θ]): 205 (+13750), 224

(−9833), 245 (+12333); phổ khối lượng phân giải cao (+)-HR-ESI-MS m/z 301,1044

[M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C15H18O5Na: 301,1046); CTPT: C15H18O5,

M = 278.

3.4.12. Hợp chất MW12: Menverin A

Chất dạng dầu không màu, [α]D20 -160 (c 0,09, CDCl3); UV (MeOH): 273

(4,06), EI-MS: 246 [M+], 231, 228, 217, 203, 185, 167, 149, 97, 57 (100), phổ khối

lượng phân giải cao HR-EI-MS: 246,1270 (tính tốn lý thuyết cho cơng thức

C15H18O3+ : 246,1256); CTPT: C15H18O3, M = 246.

3.4.13. Hợp chất MW13: Menverin B

Chất dạng dầu không màu, [α]D20 -53 (c 0,08, CDCl3); UV (MeOH): 273 (3,69);

EI-MS: 246 [M+], 231 (100), 228, 217, 203, 185, 167, 149, 97, 57. Phổ khối lượng phân

giải cao HR-EI-MS: 246,1241 (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C 15H18O3+ : 246.1256);

CTPT: C15H18O3, M = 246.

3.4.14. Hợp chất MW14: Menverin C

Chất dầu không màu, [α]D20 -152 (c 0,375, CDCl3); UV (MeOH): 275,5 (4,35);

EI-MS: 262 [M]+, 244, 229, 201, 187, 167, 124 (100), 96. Phổ khối lượng phân giải cao

HR-EI-MS: 262,1199 (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C 15H18O4+ : 262,1205). CTPT:

C15H18O4, M = 262.

3.4.15. Hợp chất MW15: Menverin F

Chất dầu không màu, [α]D22 +12 (c 0,13, CDCl3); UV (MeOH): 214 (3,9); CD

(MeOH, c = 0.6): 203 (+4849,02), 224 (- 3437.94). ESI-MS: 579 [2M + Na] +. Phổ khối

lượng phân giải cao HR-ESI-MS: 579,2189 [2M + Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công

thức C30H36O10+Na: 579.2206). CTPT: C15H18O5, M = 278.

3.4.16. Hợp chất MW16: Menelloide B

Chất dầu không màu, [α]D25 -30 (c 0,1, CDCl3); ESI-MS: m/z 269 [M+Na]+;

HR-ESI-MS: m/z 269,1152 (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C 15H18O3+Na: 269,1154).

CTPT: C15H18O3, M = 246

3.4.17. Hợp chất MW17: 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-Guaianediol



12

Chất rắn màu trắng; [α]D25 +45o (c=0,10, CHCl3); ESI-MS: m/z 237 [M−H]−

CTPT: C15H26O2, M = 238.

3.5. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được

Bảng 3.2. Kết quả xác định giá trị IC50 của các hợp chất được lựa chọn

Giá trị IC50 (µg/ml)



Hoạt

chất

MW1

MW4

MW6

MW10

Elliptic

ine



SK



HepG2



HL60



KB



3,80



3,02



4,46



Mel2

4,42



± 0,46

9,07



± 0,24

6,72



± 0,67

10,31



± 0,79

10,89



± 1,18

8,05



± 2,16

49,57



NIH/



LU-1



MCF7



LNCaP



4,30



4,69



4,00



3T3

4,09



± 0,68

8,39



± 0,26

8,04



±0,46

11,3



± 0,52

12,65



± 0,52

7,24



± 2,21

13,05



± 0,36

12,10



± 0,79

9,15



± 0,73

14,40



± 1,98

10,97



± 1,76

10,67



± 0,56

25,49



± 2,67

51,44



± 2,49

55,63



± 1,62

46,10



± 2,54

46,26



± 1,50

33,16



± 2,28

49,55



± 1,40

0,42



± 2,52

0,46



± 1,45

0,52



± 4,52

0,39



± 3,77

0,45



± 3,62

0,47



± 6,60

0,38



± 3,01

0,38



± 0,08



± 0,03



± 0,09



± 0,05



± 0,02



± 0,02



± 0,07



± 0,02



Kết quả xác định giá trị IC50 của 17 chất sạch trên 07 dòng tế bào ung thư:

HepG2, HL60, KB, SKMel2, LU-1, MCF7, LNCaP và 01 dòng tế bào lành NIH/3T3

cho thấy MW1, MW4, MW6 và MW10 có mức hoạt tính tốt. Hợp chất MW1 có mức

hoạt tính tốt nhất với giá trị IC 50 = 3,02 - 4,69 µg/ml trên tất cả các dòng tế bào ung thư

khác nhau, MW4 có mức hoạt động với giá trị IC 50 = 6,72 - 12,65 µg/ml và MW6 có

giá trị IC50 = 8,05 - 14,40 µg/ml, còn hợp chất MW10 thể hiện hoạt tính trung bình trên

các dòng tế bào ung thư với giá trị IC 50 trong khoảng 25,49 - 55,63 µg/ml (Bảng 3.2)

3.6. Kết quả xác định hoạt tính ức chế sản sinh ROS

Đặc tính ức chế sản sinh ROS của các hợp chất steroid (MW1-MW7) trong

đại thực bào đã được thực hiện để sơ bộ tìm hiểu cơ chế ức chế tế bào ung thư của các

hợp chất thu được. Bằng phương pháp MTT, chúng tôi đã chứng minh được các hợp

chất này khơng thể hiện độc tính trong đại thực bào RAW 264.7 ở khoảng nồng độ

0,001 – 50 µM. Ở nồng độ 10 µM, các hợp chất MW1, MW4 và MW6 cho thấy tác

dụng giảm mức độ biểu hiện của ROS ở mức có ý nghĩa thống kê trong đại thực bào

được cảm ứng bởi lipopolysaccharide (LPS) từ E.coli.

Cụ thể, hợp chất MW1 và MW4 làm giảm sự hình thành ROS trong đại thực

bào với giá trị lần lượt là 34.03 ± 4,2% (p < 0,05) và 27,97 ± 1,7% (p < 0,05). Hợp chất

MW6 thể hiện tác dụng hiệu quả nhất là giảm ROS trong tế bào Raw 264.7 ở mức

39,16 ± 7,3% (p < 0,05), khi so sánh với LPS. Ngược lại, các hợp chất MW3 và MW5



13

lại làm tăng mức độ biểu hiện của ROS trong đại thực bào, tuy nhiên chưa ở mức có ý

nghĩa (p > 0,05) (Hình 3.4).

Hình 3.4. Mức độ biểu hiện của ROS trong đại thực bào được kích thích bởi LPS

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. Hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết thô

Từ kết quả trên, có thể nhận thấy rằng mẫu san hơ mềm Menella woodrin có hoạt tính

gây độc tế bào ung thư thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau ở mức tương đối tốt. Tuy

nhiên, tại thời điểm chúng tôi bắt đầu nghiên cứu từ tháng 04/2014 ở Việt Nam và trên

thế giới, chưa có bất cứ cơng trình nghiên cứu nào cơng bố về thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học từ lồi này nên chúng tơi ưu tiên tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh

học nhằm phát hiện và tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu của loài này. Mặt khác, cho

tới thời điểm hiện tại thì vẫn chưa có thêm cơng trình nghiên cứu nào của các nhóm tác

giả khác cơng bố, vậy nên việc chúng tôi phát hiện được các hợp chất và đánh giá hoạt

tính sinh học từ lồi Menella woodin vẫn còn nguyên tính thời sự và tính mới.

4.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lồi Menella woodin

4.1.1. Hợp chất MW1: Menellsteroid E (1β,3β,5α,11β-Tetrahydroxycholestan-6-one)

(chất mới)



Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW1

Hợp chất MW1 được phân lập từ loài Menella woodin dưới dạng chất bột màu

trắng. Cơng thức phân tử của nó được xác định là C 27H46O5 dựa trên phổ HR-ESI-MS

với pic ion giả phân tử tại m/z 473,3232 [M+Na]+ và phổ 13C-NMR. Trên phổ 13C-NMR

xuất hiện 27 tín hiệu cacbon bao gồm năm metyl, chín metilen, chín metin và bốn

cacbon gắn với nhóm oximetin xuất hiện tại δC 71,9, 65,3, 71,1, 82,1 và có một nhóm

nhóm keton tại δC 213,2. Phổ 1H-NMR và HSQC cho phép xác định sự có mặt của 2

nhóm metyl bậc ba [δC 14,0 (C-18) và 12,4 (C-19)/δH 0,87 (H-18) và 0,93 (H-19), mỗi

tín hiệu 3H, s] và ba nhóm metyl bậc hai [δC 14,0 (C-21), 22,9 (C-26) và 23,2 (C-27)/δH

0,97 (H-21), 0,87 (H-26) và 0,88 (H-27), mỗi tín hiệu 3H, d, J = 6,7 Hz]. Các tín hiệu

proton tại δH 3,90 (m, H-3), 4,10 (dd, J =11,3; 5,2 Hz, H-1) và 4,37 (br dd, J =6,1; 4,7



14

Hz, H-11) gợi ý cho một hợp chất polyhydroxysterol dạng khung cholestan với 3 nhóm

CH-O, một nhóm >C
So sánh số liệu phổ NMR của MW1 với các số liệu tương ứng của

menellsteroid D (Chai XY, 2010) cho thấy hợp chất MW1 chỉ khác so với menellsteroid

D là sự xuất hiện thêm một nhóm hydroxyl tại C-11. Vị trí của nhóm hydroxyl này

được xác định bằng phổ COSY và HMBC: Proton H-11 tại δH 4,37 có tương tác với H9 và H2-12 trên phổ 1H-1H COSY và có tương tác xa với C-8, C-9 và C-13 trên phổ

HMBC. Cấu hình tương đối của MW1 được xác định bằng phổ ROESY. Tín hiệu tương

tác NOE của СH3-19 (δH 0,93, s) với Hβ-2 (δH 1,50, m), Hβ-4 (δH 1,61, dd, J =13,8; 11,7

Hz) và H-8 (δH 2,01, qd, J =11,1; 5,0 Hz) cùng với tương tác của H α-4 (δH 1,83, ddd, J

=13,8; 4,6; 2,0 Hz) với H-3 (δH 3,90, tt, J =11,8; 4,9 Hz) và của H-1 (δH 4,10, dd, J

=11,3; 5,2 Hz) với cả H-3 (δH 3,90, tt, J =11,8; 4,9 Hz) và H-11 (δH 4,37, br dd, J =6,1;

4,7 Hz) chứng minh cấu hình β của các nhóm hydroxyl tại C-1, C-3 và C-11. Cấu hình

α của nhóm hydroxyl tại C-5 được xác định bằng cách so sánh số liệu phổ 1H và 13CNMR với các hợp chất tương tự đã được cơng bố có cấu hình 5α và 5β. Thực tế, dạng

píc và độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu H-3 và H 2-4 tương tự như các tín hiệu

của 1β,3β,5α-trihydroxycholestan-6-one (Chai XY, 2010) và topsentisterol C1 (Luo X,

2006), hai hợp chất đều có cấu trúc 3β,5α-diol-6-one và khác so với các tín hiệu tương

ứng của 1α,3β,5β,11α-tetrahydroxycholestan-6-one (Chao CH, 2005). Từ các phân tích

đã nêu, cấu trúc hóa học của hợp chất MW1 được xác định là 1 β,3β,5α,11βtetrahydroxycholestan-6-one. Đây là một chất mới.

4.1.2. Hợp chất MW2: Menellsteroid F (Cholest-24-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol) (chất

mới)



Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW2

Hợp chất MW2 cũng được phân lập từ lồi M. woodin, có cơng thức phân tử là

C27H46O4 được xác định bằng phổ HR-ESI-MS với píc ion giả phân tử tại m/z 457,3299

[M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức C27H46O4Na, 457,3288) và phổ 13C-NMR.

Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR tương tự như các số liệu đã được công bố của các hợp



15

chất cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol (Chao CH, 2005; Zhang W, 2006b) và cholest-22-ene3β,5α,6β,11β-tetraol (Zhang W, 2006b), cho thấy sự trùng lặp về các tín hiệu của vòng

A, B và C. Sự khác biệt đáng kể chỉ được ghi nhận ở các tín hiệu của mạch nhánh

Sự xuất hiện các tín hiệu của hai nhóm metyl gắn với nối đơi (δH 1,59 và 1,66,

mỗi tín hiệu 3H s; δC 17,7 và 25,9), một nhóm metin olefin (δH 5,08, br t, J =7,3 Hz; δC

126,2), một carbon bậc bốn (δC 131,7) và secondary methyl (δH 0.96, d, J =6.7 Hz; δC

19,1) chứng minh sự trùng nhau về cấu trúc mạch nhánh của MW2 với lanosterol, một

tiền chất sinh tổng hợp của các polyoxysterol (Knight SA, 1974). Nhận định này được

chứng minh bằng các tương tác HMBC của Me-26, Me-27 với C-24, C-25, của Me-21

với C-17, C-20, C-22 và của H-24 với C-22, C-23, Me-26 và Me-27. Ngoài ra, phân

tích chi tiết các phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều như HSQC, HMBC, COSY và

NOESY chứng minh cấu trúc hóa học của MW2 là cholest-24-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol,

đây là một chất mới lần đầu tiên được phát hiện từ hợp chất thiên nhiên.

4.1.3. Hợp chất MW3: Menellsteroid G (24-methylcholest-24(28)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol) (chất mới)

Hợp chất MW3 được phân lập từ loài M. woodin dưới dạng chất bột màu trắng.

Công thức phân tử của nó được xác định là C 28H48O4 bằng phổ HR-ESI-MS với pic ion

giả phân tử tại m/z 471,3450 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C28H48O4Na:

471,3450) và phổ 13C-NMR.



Hình 4.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW3

So sánh số liệu phổ 1H và 13C-NMR của MW3 với các số liệu tương ứng của

MW2 cho thấy các tín hiệu tại δH 3,98 (tt, J =11,0; 5,7 Hz, δC 68,3, HC-3), 3,41 (dd, J

=3,7; 2,2 Hz; δC 76,4, CH-6), 4,11 (br dd, J =6,5, 3,2 Hz; δC 69,4, CH-11) và một tín

hiệu carbon bậc bốn tại δC 77,5. Sự tương đồng về số liệu phổ giữa hai hợp chất cho

phép xác định hai hợp chất này có cùng cấu trúc nhân steroit 3β,5α,6β,11β-tetraol.

Tương tự như ở hợp chất MW2, năm nhóm metyl cũng được xác định trên các

phổ của MW3 tại δH 0,92, s; δC 14,9, Me-18; δH 1,37, s; δC 20,3, Me-19; và δH 0,98, d, J

=6,5 Hz; δC 19,2, Me-21. Các tín hiệu xuất hiện thêm trên phổ 1H-NMR tại δH 4,64 (br

s) và 4,71 (br s) được gán cho nhóm metilen của liên kết đơi ở đầu mạch ( δC 106,9 và



16

157,8). Các dữ kiện đã nêu, cùng với tín hiệu proton metyl tại δH 1,02 (6H, d, J =6,8

Hz) có tương tác HMBC với tín hiệu cacbon tại δC 157,8 và tương tác HMBC của các

proton của nhóm olefin metilen với C-23 (δC 32,2) và C-25 (δC 34,9), chứng minh hợp

chất MW3 có cấu trúc mạch nhánh dạng 24-methylene-cholestane. Phân tích các dữ

kiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều như HSQC, HMBC, COSY và NOESY và

các dữ kiện đã thu được, cấu trúc hóa học 24-methylcholest-24(28)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol được xác định cho hợp chất MW3, một chất mới.

4.1.4. Hợp chất MW4: Menellsteroid H (24-Norcholest-22(E)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol) (chất mới)

Hợp chất MW4 cũng được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng với công

thức phân tử C26H44O4, được xác định bằng phổ HR-ESI-MS tại m/z 443,3124 [M+Na]+

(tính tốn lý thuyết cho công thức C26H44O4Na: 443,3137).

Số liệu phổ NMR của MW4 tương tự như các số liệu của hợp chất

menellsteroid B (Zhang W, 2006b), ngoại trừ sự mất đi các tín hiệu của nhóm CH 2-24.

Tương tác HMBC (đo trong C5D5N) của các proton Me-26 và Me-27 (δH 0,9, 6H, d, J

=6,8 Hz) với C-25 (δC 32,3) và C-23 (δC 135,1) cũng như tương tác của proton Me-21

(δH 1,08, 3H, d, J =6,6 Hz) với C-17 (δC 57,1), C-20 (δC 40,5) và C-22 (δC 134,4) chứng

minh cấu trúc hóa học của MW4 là 24-norcholest-22(E)-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol, một

chất mới.



Hình 4.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW4

4.1.5. Hợp chất MW5: cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol

Phổ 1H và 13C-NMR của MW5 tương tự như phổ của các hợp chất MW2-MW4.

Sự khác biệt giữa các hợp chất chỉ được ghi nhận ở các tín hiệu của mạch nhánh. Trên

phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu của ba nhóm oximetin tại δH 3,98 (1H, tt, J = 11,0,

5,5 hz, H-3), 3,42 (1H, dd, J = 3,8, 2,4 Hz, H-6) và 4,22 (1H, dd, J = 6,5, 3,3 Hz, H-11)

và hai nhóm metyl bậc ba (mỗi tín hiệu 3H, s) tại 0,91 (H-18) và 1,36 (H-19). Ngoài ra,



17

sự xuất hiện 3 tín hiệu cacbon bậc hai (mỗi tín hiệu 3H, d, J = 6,5 Hz) tại 0,94 (H-21),

0,87 (H-26) và 0,88 (H-27) gợi ý cho cấu trúc mạnh nhánh dạng cholesterol. Sự phù

hợp về số liệu phổ 13C-NMR với các số liệu tương ứng đã được công bố cho phép xác

định MW5 chính là cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol (Zhang W, 2006b).

4.1.6. Hợp chất MW6: Menellsteroid B (cholest-22-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol)

Hợp chất MW6 cũng được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Các phổ

NMR của nó chứng minh đây là một hợp chất steroit có phần nhân steroit trùng với các

hợp chất MW2-MW5, chỉ khác cấu trúc của mạch nhánh. So sánh số liệu phổ 13C-NMR

với các số liệu đã được cơng bố, kết hợp phân tích chi tiết các tương tác trên phổ cộng

hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC, HMBC, COSY và ROESY cho phép khẳng định

hợp chất MW6 chính là Menellsteroid B (Zhang W, 2006b).

4.1.7. Hợp chất MW7: (22E,24S)-24-methyl-5α-cholesta-7,22-diene-3β,5,6β,9-tetraol

Các phổ NMR của MW7 cũng đặc trưng cho một hợp chất polyhydroxysteroit.

Trên phổ 1H và 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của hai nhóm oximetin, hai

carbon bậc bốn mang oxi, hai nhóm metyl bậc ba, bốn nhóm metin bậc hai và một liên

kết đơi ngoại vòng bị thế hai vị trí. Sự phù hợp về số liệu phổ NMR của MW7 với các

số liệu đã được công bố cho phép xác định hợp chất này chính là (22E,24S)-24-methyl5α-cholesta-7,22-diene-3β,5,6β,9-tetraol (Migliuolo A, 1990).

4.1.8. Hợp chất MW8: (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7-trien-12,8olide (chất mới)

Hợp chất MW8 được phân lập dưới dạng chất dầu màu vàng nhạt, [α] 26D +217,3

(c 0,15, CHCl3), Cơng thức phân tử của nó C15H16O4 được xác định bằng phổ khối

lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 283,0938 [M+Na]+, tính tốn lý thuyết cho

cơng thức C15H16O4Na+, 283,0941, Phổ UV xuất hiện pic hấp phụ mạnh ở 309 chứng

minh cho sự có mặt của cấu trúc liên hợp, Các phổ NMR chứng minh sự có mặt của ba

nhóm metyl, một metilen, bốn metin và bảy carbon bậc bốn bao gồm hai carbon mang

ôxi, bốn >C= và một >C=O, Hai tín hiệu metyl singlet trên phổ 1H-NMR (δH 1,91 và

1,98) có tương tác HSQC với các cacbon tại δC 8,2 (Me-13) và 12,3 (Me-14), trong khi

tín hiệu metyl doublet (δH 0,85) tương tác với carbon tại δC 15,1 (Me-15), Nhóm

oximetin được xác định bởi các tín hiệu cộng hưởng tại δH 4,53 và δC 75,7, Cùng với

các tín hiệu của một carbonyl γ-lactone tại δC 171,7 (C-12) và một nhóm ketal tại δC

107,0 (C-8), các số liệu phổ NMR cho phép dự đốn MW8 là một sesquitecpen có cấu

trúc khung guaiane có chứa hệ liện hợp triene, nhóm chức γ-lactone, ketal và oximetin.



18



Hình 4.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW8

Vị trí của nhóm oximetin tại C-2 được xác định bằng tương tác HMBC giữa H2 và C-3, C-4, C-5 và C-10. Các tín hiệu proton ở vùng trường thấp tại δH 6,23 (H-3) và

6,37 (H-6) có tương tác HSQC với các tín hiệu tại δC 139,2 và 109,1. Tương tác xa

HMBC giữa H-3 và C-1, C-2, C-4, C14; H3-14 và C-3, C-4, C-5; H-6 và C-1, C-5, C-6,

C-7 và giữa H3-13 và C-7, C-11, C-12 chứng minh sự có mặt của cấu trúc liên hợp trien

với hai nhom metyl tại C-4 và C-11. Xem xét công thức phân tử của MW8 cùng với dữ

liệu mơ hình hóa phân tử và giá trị độ dịch chuyển hóa học C-1 (δC 90,5) và C-8 (δC

107,0), gợi ý cho sự có mặt của một cầu epoxy tại C-1/C-8. Các tín hiệu của nhóm

metilen (δH 1,68 (dd, J =12,7, 6,4 Hz), 2,68 (dd, J =12,7, 11,2 Hz) và δC 38,8) được gán

cho CH2-9 trên cơ sở các tương tác HMBC của H2-9 với C-15, C-10, C-8 và C-7. Các

dữ kiện đã nêu chứng minh chính xác cấu trúc phẳng của MW8.

Lập thể tuyệt đối tại vị trí C-2 được xác định bằng phương pháp Mosher cải tiến

(Seco JM, 2004). Xử lý MW8 với (R)(-)- và (S)(+)-α-methoxy-α (trifluoromethyl)

phenylacetyl chloride cho các dẫn xuất tương ứng là (S)- và (R)-MTPA ester. Các tín

hiệu 1H-NMR của các dẫn xuất MTPA ester được xác định bằng phổ COSY. Phân tích

số liệu ΔδH(S–R) cho thấy sự thay đổi tăng độ dịch chuyển hóa học của H-3 (+0.14 ppm)

và H3-14 (+0.07 ppm) và giảm của H 2-9 (H-9a: −0.02 ppm, H9b: −0.02 ppm), chứng

minh cấu hình 2R của MW8. Lập thể của cầu epoxy được xác định là β (1S,8S) trên cơ

sở phân tích phổ ROESY experiment. Tương tác NOE rõ ràng từ H-2 sang cả Me-15 và

H-10 đã được ghi nhận. Phân tích mơ hình tối ưu hóa năng lượng cho cả hai dạng lập

thể 1S,2R,8S và 1R,2R,8R cho thấy các tương tác NOE trên chỉ phù hợp cho lập thể β

của nhóm epoxy. Phù hợp với tương tác NOE giữa Me-15 và H-9a (δH 1,68, dd, J

=12,7; 6,4 Hz) và và giá trị hằng số tương tác, H-10 (δH 2.59, dquint J =11,2, 6,6 Hz)

nằm ở vị trí cis với H-9b (δH 2,68, dd, J =12,7; 6.4 Hz), tuy nhiên việc xác định từng

proton của H2-9 là α hay β là khơng thể do đó các dữ kiện trên chưa đủ để quy kết cấu

hình tại C-10. Tính tốn hóa lượng tử (Quantum-chemical calculations) sử dụng B3LYP

(Stephens PJ, 1994) cùng với hệ cơ bản 6-311G(d,p) và PCM (polarisation-continuum



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Kết quả phân loại từ mẫu san hô mềm thu từ chuyến khảo sát tại Bắc Hồng Vàn ở quần đảo Cô Tô đã xác định được 1 loài san hô mềm thuộc họ Plexauridae là loài Menella woodin (Hình 3.2).

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×