Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
b. Phương pháp phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1

b. Phương pháp phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1

Tải bản đầy đủ - 0trang

30



biến đảo đoạn intron 1, phản ứng 1 chỉ có mồi int1h1 bắt cặp cho kích thước

1908 bp. Ở phản ứng 2 chỉ có mồi đặc hiệu cho int1h2 bắt cặp cho kích thước

1191 bp. Nếu đột biến xảy ra, mồi int1h1 bắt cặp với int1h2 ở cả hai phản ứng sẽ

cho các kích thước 1323 bp và 1776 pb tương ứng ở phản ứng 1 và phản ứng 2.

*Phát hiện đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen F8

Trong những năm gần đây, MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe

Amplification) là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột

biến mất đoạn, lặp đoạn gen F8. Kỹ thuật MLPA (khuếch đại đa đoạn dò)

được mơ tả lần đầu vào năm 2002 bởi Schouten J.P. và CS, đây là phiên bản

mới của phản ứng PCR, trong đó nhiều đoạn DNA đích được khuếch đại chỉ

bằng 1 cặp mồi [42].

- Kỹ thuật MLPA sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai hóa với

phân tử DNA đích đặc hiệu và vấn đề thiết kế các probe rất quan trọng.

Mỗi đoạn dò gồm 2 chuỗi oligonucleotide có kích thước khác nhau (gọi

là đoạn dò xi và đoạn dò ngược).

+ Đoạn dò xi: gồm Đầu 5’và đầu 3’, đoạn ngược gồm: Đầu 3’, đầu

5’và phần nối giữa đầu 5’ với đầu 3’. Các đoạn probe sẽ gắn đặc hiệu vào các

exon của phân tử DNA đích, sau đó enzym ligase được thêm vào để nối hai

đoạn probe này lại với nhau tạo thành đoạn probe hoàn chỉnh và được khuếch

đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Phân tích kết quả MLPA là

bước quan trong trong kỹ thuật. Phân tích được tiến hành dựa trên hành ảnh,

dữ liệu thô tương ứng với từng probe.

Phân tích gián tiếp

Phân tích gián tiếp dựa trên việc phân tích di truyền sự đột biến dựa vào sự

đa hình thái của các alen. Đa hình là những thay đổi dựa trên trình tự nucleotid

của gen dẫn đến tính đa dạng tạo ra sự khác biệt giữa người này và người khác

nhưng không ảnh hưởng tới chức năng của gen đó, đa hình phải nằm trên nhiễm



31



sắc thể X, di truyền cùng gen yếu tố VIII và mang thơng tin. Giá trị thơng tin đa

hình là tần suất xuất hiện, tỷ lệ dị hợp tử và tương tác liên kết với đa hình khác.

Giá trị này khác nhau giữa các chủng tộc người. Người dị hợp tử về đa hình nào

là người có hai alen khác nhau về đa hình đó trên hai nhiễm sắc thể X của mình

và được gọi là có thơng tin. Tỷ lệ dị hợp tử đa hình càng cao thì khả năng chẩn

đốn càng tốt. Tỉ lệ dị hợp tử của các marker đa hình này rất thay đổi ở các tộc

người khác nhau. Bên cạnh đó, có một sớ đa hình liên kết tương quan với nhau.

Nói cách khác là có một alen của đa hình này liên kết với một alen của đa hình

khác vì vậy khi phới hợp 2 đa hình này với nhau sẽ ít làm tăng tỉ lệ có thơng tin.

Chính vì vậy, để đảm bảo hiệu quả cho việc chẩn đốn, việc chọn lựa sử dụng

đa hình nào cần căn cứ vào tỉ lệ dị hợp tử cũng như sự liên kết tương quan giữa

các đa hình của quần thể người đó.

1.4. PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) VÀ

QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN TRƯỚC LÀM TỔ (PGD)

1.4.1. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)

Sự thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm được đánh

dấu bằng sự ra đời của đứa trẻ đầu tiên theo phương pháp này vào năm 1978

[43]. Tính trung bình ở các nước như Thụy Điển, Úc và Hoa Kỳ thì cứ khoảng

50-80 trẻ thì có một trẻ được sinh ra bằng phương pháp thụ tinh trong ống

nghiệm. Hàng năm có khoảng hơn 120 nghìn cặp vợ chồng ở Hoa Kỳ thực

hiện thụ tinh trong ống nghiệm [44]. Trong tương lai, sớ trẻ ra đời bằng

phương pháp này sẽ còn tăng cao bởi sự gia tăng độ tuổi trung bình khi kết

hơn, độ tuổi trung bình khi mang thai lần đầu và sự gia tăng về tỷ lệ vô sinh

của các cặp vợ chồng trên thế giới [45].

Quy trình thường quy của IVF được thực hiện theo trình tự bắt đầu từ

việc kích thích các nang nỗn bằng FSH (Hình 1.13). Các bệnh nhân được

chọc hút trứng sau khi tiêm HCG từ 34-36 giờ [46]. Tinh trùng của bệnh nhân



32



được lấy vào lọ vô trùng, không độc trong ngày chọc hút trứng. Mẫu tinh

trùng được ly giải và xử lý theo quy trình chuẩn rồi đánh giá mật độ tinh trùng

và độ di động theo tiêu chuẩn của WHO-2010. Trứng được thụ tinh in vitro

bằng cách nuôi cấy với tinh trùng hoặc tiêm trực tiếp tinh trùng vào bào tương

của trứng (Intracytoplasmic sperm injection, ICSI) và ni cấy trong vòng 2-5

ngày [47]. Đánh giá chất lượng phôi vào ngày thứ 2, thứ 3 và thứ 5 dựa vào

số lượng, độ đồng đều của phôi bào, độ chiết quang, độ liên kết phôi bào,

phần trăm mảnh vỡ và tốc độ phân chia của phơi bào. Các phơi làm PGD còn

được đánh giá thêm sớ phơi bào thối hóa và sớ phơi phân chia tiếp sau PGD

[48]. Phôi được chuyển vào tử cung bằng catheter chuyển phôi dưới siêu âm

đường bụng, kỹ thuật chuyển phôi đạt tiêu chuẩn khi chuyển phôi dễ, catheter

sau chuyển phơi sạch, khơng nhầy máu, khơng sót phơi, không kẹp cổ tử cung

và không nong cổ tử cung.

Tỷ lệ trẻ sinh sống sau khi chuyển phôi ở các bà mẹ có độ tuổi 34 hoặc

trẻ hơn dao động trong khoảng 30-49%. Sau đó, khi độ tuổi của các bà mẹ

tăng thêm một tuổi thì tỷ lệ này giảm đi tương ứng từ 2-6% và đới với phụ nữ

có độ tuổi 43 trở lên thì tỷ lệ trẻ sinh sớng sau chuyển phơi chỉ còn khoảng

5%. Như vậy, tỷ lệ thành công của phương pháp IVF liên quan chặt chẽ đến

độ tuổi của người mẹ, đến chất lượng trứng và nguyên nhân có thể do các bất

thường nhiễm sắc thể gia tăng đối với các bà mẹ lớn tuổi.

Khi thực hiện IVF, thông thường các bác sỹ cùng lúc cấy chuyển nhiều

phôi vào tử cung để gia tăng tỷ lệ mang thai. Điều này làm tăng tỷ lệ mang

thai đơi và thai ba. Bên cạnh đó việc mang thai đôi, thai ba cũng làm gia tăng

tỷ lệ sinh non và trẻ sinh ra bị thiếu cân [49-50]. Tuy nhiên, cần phải nhấn

mạnh rằng, thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm đã mang

lại hạnh phúc khi được làm cha mẹ cho rất nhiều cặp vợ chồng hiếm muộn.

Đây thực sự là những thành tựu y học mà các bác sỹ và nhân viên y tế đã

mang đến cho nhiều gia đình và cho xã hội.



33



Hình 1.12. Quy trình thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm

A, B: Kích thích nang noãn chín và theo dõi bằng siêu âm. C: Chọc hút trứng

dưới sự hướng dẫn của siêu âm. D-F: Thụ tinh in vitro bằng cách tiêm trực tiếp

tinh trùng vào bào tương của trứng. G-I: Phôi tiếp tục được nuôi cấy và đánh giá

chất lượng của phôi và chuyển vào tử cung (I).



1.4.2. Quy trình chẩn đốn gen trước làm tổ (PGD)

Kỹ thuật PGD (Preimplantation genetic Diagnosis) hay PGT (Preimplantation

genetic testing) hiện nay là một kỹ thuật hoàn chỉnh, cho phép các cặp vợ

chồng có nguy cơ truyền các bệnh lý di truyền cho con có thể có cơ hội sinh

con không mắc bệnh mà không phải chẩn đoán tiền sản sau khi mang thai và

bỏ thai khi phát hiện bệnh lý ở thai [51]. Kỹ thuật PGT-M: chẩn đoán các

bệnh đơn gen, giúp các cặp vợ chồng xác định thai không bị bệnh về gen do

di truyền từ cha mẹ mang gen đột biến (bệnh thiếu máu tán huyết

Thalassemia, bệnh máu khó đơng Hemophilia...). Kỹ thuật này dựa trên việc

phát hiện các bất thường di truyền ở phơi (in-vitro) và chỉ cấy trở lại vào lòng

tử cung các phơi khơng có các bất thường về di truyền [52-54].

1.4.2.1. Lịch sử phát triển của kỹ thuật chẩn đoán trước làm tổ

PGD được báo cáo lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1990 [3],[55]. Chỉ

định chẩn đoán PGD áp dụng cho các trường hợp bệnh lý vùng Địa trung hải

như Cystic Fibrosis (CF) và các bệnh lý di truyền liên kết với nhiễm sắc thể X



34



(X-linked disorders) [3]. Trong báo cáo đăng trên tạp chí Nature, Handyside và

cộng sự đã báo cáo trường hợp có thai từ các phơi đã được sinh thiết và chẩn

đốn di truyền bằng cách khuếch đại các đoạn DNA đặc trưng trên nhiễm sắc

thể Y thông qua kỹ thuật PCR. Handyside và Cs đã thực hiện cho 5 cặp vợ

chồng có bệnh lý liên quan đến nhiễm sắc thể X, phôi gái được chọn và cấy

vào tử cung, kết quả là có 2 trường hợp thai đôi và 1 thai đơn khỏe mạnh. Tuy

nhiên, trong 3 năm đầu phát triển, chỉ có 1 số trường hợp sinh sống từ phôi

PGD được báo cáo [55-56]. Vào năm 1993-1994, kỹ thuật FISH (Fluorescent

in situ hybridization) bắt đầu được áp dụng trong PGD để chẩn đoán các bất

thường nhiễm sắc thể. FISH được sử dụng để phân tích các rới loạn nhiễm sắc

thể, chủ yếu các lệch bội thể (aneuploids) và cho phép chẩn đốn chính xác hơn

và giảm tỷ lệ sai sót so với phương pháp PCR [57]. PGD đã phát triển nhanh

chóng và sớ trường hợp sinh sống từ phôi PGD trên thế giới bắt đầu tăng mạnh.

Chỉ trong vòng 2 năm sau đó, hơn 100 trường hợp sinh sống từ phôi PGD đã

được báo cáo trên thế giới. Vào năm 1996, PGD tiếp tục một bước phát triển

mới khi người ta bắt đầu xác định được chuyển đoạn nhiễm sắc thể và ứng

dụng vào PGD. Kỹ thuật chẩn đoán di truyền này giúp xác định các phơi khơng

có bất thường về cấu trúc nhiễm sắc thể trước khi cấy vào tử cung [58]. Từ

năm 1999, PGD lại được mở rộng chỉ định để chẩn đốn phơi có mang các gen

liên quan đến các bệnh lý sau này ở đứa trẻ. Đây là một chỉ định mới so với các

chỉ định trước đây của chẩn đốn tiền sản. Chỉ định này cho phép bớ mẹ có

mang gen tiềm ẩn một bệnh lý được dự báo trước có thể sinh ra một trẻ hồn

tồn khơng mang gen bệnh. Điều này mang đến khả năng ứng dụng rất lớn của

PGD khi các nhà khoa học ngày càng phát hiện nhiều bệnh lý ở người có liên

quan đến di truyền [59]. Cho đến nay PGD được sử dụng như một phương tiện

chẩn đoán lâm sàng trong điều trị và áp dụng một cách rộng rãi hơn. Hàng năm

số trường hợp PGD tăng gần gấp đôi, hàng chục ngàn trẻ ra đời từ các trung

tâm IVF trên thế giới sau chẩn đốn PGD và khơng có ảnh hường xấu nào.



35



1.4.2.2. Quy trình kỹ thuật chẩn đốn trước làm tổ

Quy trình PGD được thực hiện bằng cách lấy tế bào từ mỗi phơi trong

IVF để phân tích [60]. Tế bào được lấy ngày thứ 3, ngày thứ 5 sau thụ tinh

trong giai đoạn phát triển phôi [61],[62]. Phôi ngày thứ 3 có hiện tượng lệch

bội nhiễm sắc thể và tỷ lệ thể khảm khá cao [63], đến giai đoạn phơi nang thì tỷ

lệ này giảm và phơi ngày thứ 3 có khả năng tự sửa chữa được [64]. Hiện tượng

này là do ngày thứ 3 hệ thống gen của phơi chưa hồn tồn biệt hóa [65]. Mặt

khác ở những phơi có khả năng tự sửa chữa này thì các phơi bào có sớ lượng

NST bình thường có khả năng phân chia tớt hơn có xu hướng di chuyển biệt

hóa thành mầm phôi, các phôi bào bất thường sẽ ngừng phát triển [66]. Mặc dù

các nghiên cứu cho thấy sinh thiết phơi nang chẩn đốn chính xác cao hơn, vì

sinh thiết được nhiều phơi bào hơn, thể khảm ít hơn, nhưng sinh thiết phôi ngày

3 vẫn được áp dụng ở nhiều trung tâm trên thế giới. Bên cạnh đó, sinh thiết

phơi nang cũng gặp khó khăn như nguy cơ phơi thối hóa sau sinh thiết cao

hơn, phơi nang khơng còn tính phát triển tồn năng như phơi ngày 3. Hơn nữa,

phôi nang sau sinh thiết xong thường phải đem đông lạnh chờ đến chu kỳ sau

mới tiến hành chuyển phôi, như vậy nguy cơ thối hóa phơi sau đơng phơi sẽ

tăng lên. Trong khi đó, sinh thiết phơi ngày 3 khả năng sớng sót cao hơn, cải

thiện khả năng làm tổ cũng như tỷ lệ có thai. Hạn chế chính của sinh thiết phôi

ngày 3 là tỷ lệ khảm của phơi cao dẫn đến bỏ sót chẩn đốn. Việc sử dụng hai

phơi bào cho sàng lọc, chẩn đốn sẽ cho kết quả chính xác hơn. Sớ liệu cho

thấy tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang tương đương giữa 2 nhóm

phơi sinh thiết một phơi bào hay sinh thiết hai phôi bào.

Dùng kim sinh thiết lấy phôi bào nguyên vẹn và bảo quản trong điều

kiện thích hợp để thực hiện các bước tiếp theo của chẩn đoán trước làm tổ

[67]. Dựa vào kết quả chẩn đoán trước làm tổ và khả năng phân chia tiếp của

phôi để chọn các phơi có nhiễm sắc thể bình thường, khơng mang bệnh lý di



36



truyền cho việc chuyển phôi. Việc chuyển phôi vào buồng tử cung được tiến

hành vào ngày thứ 5 ở giai đoạn phơi nang. Sau đó bệnh nhân được thực hiện

các test để đánh giá khả năng mang thai và các xét nghiệm chuẩn đốn theo

dõi sự hình thành và phát triển của thai nhi trong buồng tử cung [68].



Hình 1.13. Sinh thiết phơi bào giai đoạn blastomere cho chẩn đốn PGD [69]

PGD có nhiều ưu điểm so với chẩn đốn tiền sản thơng thường. Thứ

nhất, có thể tránh được việc phải chấm dứt thai kỳ, bỏ thai. Thứ hai, đây là

một kỹ thuật thích hợp với các cặp vợ chồng bị chuyển đoạn nhiễm sắc thể,

giúp loại trừ các khả năng chuyển đoạn không cân xứng (unbalanced

translocations) xuất hiện ở thai nhi, thường dẫn đến sảy thai liên tiếp. Thứ ba,

thích hợp cho các cặp vợ chồng có nguy cơ sinh ra trẻ bị các bệnh lý thường

gặp có nguyên nhân di truyền gen lặn hay trội, đặc biệt là các bệnh di truyền

liên kết với NST giới tính. Thứ 4, các cặp vợ chồng khơng chỉ có nhu cầu sinh

con khơng bị bệnh mà còn có thể lựa chọn hệ HLA phù hợp để sử dụng máu

cuống rốn để điều trị cho anh hoặc chị lớn đã có bệnh lý di truyền.

1.4.2.3. Chỉ định của chẩn đốn trước làm tổ

Ngày nay PGD được áp dụng để chẩn đoán cho khoảng 170 bệnh lý khác

nhau. Càng ngày các nhà khoa học càng xác định được nhiều gen liên quan đến

các bệnh lý và xác định các dạng đột biến gây bệnh của các gen này. Điều này

cho phép PGD chẩn đốn xác định các phơi khơng có các gen bệnh để chọn lọc

và cấy các phôi này vào tử cung [70]. Các đối tượng khi thực hiện thụ tinh



37



trong ớng nghiệm được khuyến khích sử dụng quy trình này bao gồm: i) Các

cặp vợ chồng mang gen gây bệnh di truyền trên nhiễm sắc thể thường hoặc

liên kết với nhiễm sắc thể giới tính. ii) Những người có sự bất thường về cấu

trúc nhiễm sắc thể như mất đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn và chuyển đoạn. iii) Phụ

nữ lớn tuổi, phụ nữ tiếp xúc với hóa chất, phóng xạ… để tránh những bất

thường về nhiễm sắc thể có thể xảy ra và di truyền cho con của họ. iv) Phụ nữ

có tiền sử xảy thai, thai lưu nhiều lần. v) Các cặp vợ chồng đã được thực hiện

phương pháp IVF trước đó nhưng không thành công mà không rõ ngun

nhân. Ngồi ra, PGD hiện nay khơng chỉ giới hạn ở việc loại trừ các bệnh lý di

truyền thể hiện ngay lúc sinh mà còn được mở rộng để loại trừ các bệnh lý di

truyền khởi phát muộn do các yếu tố di truyền tiềm ẩn. Những gen này tuy

khơng chắc chắn gây bệnh nhưng người có gen này có thể có nguy cơ cao bị

một sớ bệnh lý nhất định, ví dụ như tầm sốt gen gây ung thư vú BRCA1 [71].

Gần đây PGD còn được áp dụng trong các chỉ định không liên quan đến bệnh,

như chọn lọc các phơi có hệ HLA phù hợp với trẻ bị bệnh đã sinh trước đó. Kỹ

thuật này được áp dụng để tìm phơi khỏe mạnh, đồng thời có HLA tương thích

với trẻ bị bệnh cùng bớ mẹ. Điều này cho phép sử dụng liệu pháp tế bào gốc để

điều trị bệnh cho các trẻ bệnh với nguồn tế bào gớc có hệ HLA tương thích.

Có thể thấy rằng, phương pháp chẩn đoán trước làm tổ giúp cho các

cặp vợ chồng mang bệnh lý di truyền có khả năng sinh ra được những đứa

con hoàn toàn khỏe mạnh, tuy nhiên đây là một kỹ thuật tốn kém và không

thể sàng lọc hoàn toàn các đột biến gen và bất thường NST ở phơi. Để chẩn

đốn, bệnh nhân phải thực hiện thụ tinh trong ớng nghiệm (IVF) để có phơi

bào cung cấp cho chẩn đốn mặc dù họ khơng phải là bệnh nhân vơ sinh. Hơn

nữa tỷ lệ có thai lâm sàng sau IVF ở Việt Nam chỉ khoảng 30%. Việc chẩn

đoán xác định đột biến gen và các bất thường NST chỉ từ một tế bào được

sinh thiết rõ ràng sẽ có những hạn chế nhất định, thể hiện bởi tỷ lệ thành cơng,



38



mức độ rõ ràng và chính xác của kết quả chẩn đốn. Chính vì vậy trong những

năm gần đây, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như FISH,

microsatellite DNA, microarray… đã được ứng dụng vào quy trình chẩn đốn

trước làm tổ để nâng cao tính chính xác và hiệu quả của chẩn đốn. Cần phải

nhấn mạnh rằng, việc xác định chính xác đột biến trên bệnh nhân và người

mang gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử là rất cần thiết để định hướng và

khu trú các tổn thương trước khi thực hiện chẩn đoán trước làm tổ. Do vậy

phương pháp này chỉ định chẩn đốn có chọn lọc cho nhóm nguy cơ cao như

đã trình bày ở trên.

1.4.3. Các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử mới nhất áp dụng

trong việc chẩn đốn trước làm tổ

Với sự phát triển nhanh chóng của các kỹ thuật phân tích, chẩn đốn

gen như: PCR, Multiplex-PCR, Fluorescent in-situ Hybridization (FISH),

Microsatellite DNA … và ứng dụng vào quy trình PGD đã giúp cho việc chẩn

đốn và sàng lọc được thực hiện nhanh hơn và cho kết quả chính xác hơn.

1.4.3.1. PCR và Multiplex-PCR

PCR và Multiplex-PCR là kỹ thuật nhân đoạn DNA thực nghiệm sử

dụng một cặp mồi hay cùng lúc nhiều cặp mồi khác nhau. Sản phẩm của phản

ứng khuếch đại sau đó được kiểm tra bằng cách điện di trên agarose gel để xác

định sự có mặt hay vắng mặt của đoạn DNA cần phân tích [72]. PCR là kỹ

thuật đầu tiên được áp dụng vào PGD bởi Handyside và cộng sự vào năm 1990

khi xác định các đoạn trình tự lặp lại trên nhiễm sắc thể Y để xác định giới tính

của phơi trong chẩn đoán các bệnh di truyền liên kết với NST giới tính và

chuyển các phơi khơng mắc bệnh vào tử cung. Cho đến nay, kỹ thuật PCR đã

được áp dụng rộng rãi trong PGD với độ chính xác ngày càng cao để xác định

nhiều bệnh di truyền khác nhau [69]. Hơn nữa, với việc phát triển kỹ thuật

multiplex-PCR trong PGD các nhà di truyền học có thể xác định cùng lúc



39



nhiều đột biến có khả năng di truyền từ phơi [73]. Tuy nhiên, kỹ thuật PCR còn

có nhiều hạn chế. Việc khuếch đại đoạn gen mong muốn chỉ từ một tế bào đòi

hỏi một sớ lượng lớn chu kỳ khuếch đại để có thể xác định được hình ảnh đoạn

gen cần phân tích trên agarose gel. Điều này dẫn tới nguy cơ nhiễm DNA ngoại

lai hay DNA từ chính cặp vợ chồng thực hiện PGD và IVF. Khi DNA bị nhiễm

vào mẫu PCR cần phân tích có thể làm sai lệch kết quả chẩn đốn. Để khắc

phục tình trạng này, các nhà di truyền học đã thiết lập một quy trình PCR sử

dụng trong PGD với việc khuếch đại đồng thời đoạn DNA cần phân tích và

đoạn DNA đặc hiệu khơng có nguồn gớc từ phơi thai. Như vậy, các mẫu phân

tích bị nhiễm DNA sẽ bị loại trừ và cho kết quả chẩn đốn PGD một cách chính

xác. Vấn đề khác của việc ứng dụng PCR vào chẩn đoán PGD là chỉ khoảng

80% các đoạn gen cần được phân tích được khuếch đại thành cơng khi phản

ứng được thực hiện với lượng DNA từ một phôi bào sinh thiết [73-74]. Các kỹ

thuật PCR khác như multiplex-PCR, Fluorescent PCR đều có thể làm gia tăng

tỷ lệ thành cơng của chẩn đoán. Tuy nhiên, giá thành của các kỹ thuật này cao

hơn so với kỹ thuật PCR tiêu chuẩn kể trên.

1.4.3.2. Fluorescence in situ hybridization (FISH)

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là kỹ thuật di truyền tế bào –

phân tử, sử dụng đầu dò DNA gắn huỳnh quang lai với trình tự DNA đặc hiệu

đích trên nhiễm sắc thể của tế bào ở gian kỳ hoặc các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa,

qua đó phát hiện được sự có mặt hay vắng mặt của một đoạn gen nào đó bằng

kính hiển vi huỳnh quang [75]. Với kỹ thuật FISH, các nhà di truyền có khả

năng phát hiện những bất thường do một đoạn gen nhỏ gây ra với độ phân

giải cao mà khơng còn bị lệ thuộc q nhiều vào các kỹ thuật nhuộm băng.

Kỹ thuật này đã được nghiên cứu và ứng dụng để chẩn đoán các bất thường

nhiễm sắc thể trong PGD từ những năm 1993-1994 của thế kỷ trước [76].

Hiện nay, ứng dụng rộng rãi nhất của kỹ thuật FISH trong PGD là loại 5 DNA



40



dò (13, 18, 21, X, Y) đới với lai 1 vòng và 9 DNA dò 13, 15, 16, 17, 18, 21,

22, X và Y đới với lai 2 vòng. Ngồi ra kỹ thuật FISH trong PGD còn được

dùng để chẩn đốn ung thư do mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể [76]. Kỹ thuật

FISH trong PGD là một kỹ thuật mang lại hiệu quả thành cơng cao cho IVF.



Hình 1.14. Ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đốn xác định

giới tính và số lượng nhiễm sắc thể [68]

Trong trường hợp này, các bác sỹ sử dụng tổ hợp DNA gắn huỳnh quang

phát ra 5 loại màu sắc khác nhau (NST 13: màu cam. NST 18: màu xanh, NST 21:

màu xanh lá cây, NST X: màu tím và NST Y: màu xanh sáng) để chẩn đốn giới tính

và sớ lượng NST. (A) phôi có giới tính là nam, (B) có giới tính là nữ và đều có số

lượng NST bình thường: 2 cặp NST số 13, 18 và 21.



Theo nghiên cứu của H.Malmgren và cộng sự năm 2006 sử dụng kỹ

thuật FISH phân tích từ phơi bào để xác định sự xóa đoạn exon trong gen

dystrophin gây bệnh Duchenne. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng đầu dò exon 45,

exon 46, exon 47 kết hợp với đầu dò trên trục X, Y. Kết quả bệnh nhân thực

hiện chu kỳ đầu tiên 10 phôi được 8 phơi trong đó 02 phơi nam bình thường, 2

phôi nam bất thường, 3 phôi nữ mang gen, 01 phơi nữ khơng bình thường. 02

phơi nam bình thường được cấy vào buồng tử cung người mẹ trong ngày thứ 4

nhưng không mang thai. Chu kỳ thứ 2 được 01 phơi nữ bình thường, kết quả

sinh ra bé gái khỏe mạnh. Với nghiên cứu này cho thấy việc sử dụng kỹ thuật

FISH trong PGD để xác định sự xóa đoạn gen dystrophin trên một tế bào đơn

gen bằng cách sử dụng mảng lai gen là sự lựa chọn tốt [77].



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

b. Phương pháp phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×