Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

Tài liu lun vn s phm 20 of 63.



Acid citric

Nước dừa già



1000ml



Nước vo gạo

Nước cất 2 lần



1000ml

1000ml



Bước 2: Dùng máy khuấy từ để khuấy đều các loại môi trường nuôi cấy

cho đến khi bão hòa.

Bước 3: Cho dung dịch đã khuấy vào nồi hấp khử trùng ở 1130C trong 15

phút để tiêu diệt vi khuẩn và nấm mốc.

Bước 4: Đưa môi trường tạo màng VLC vào buồng cấy vô trùng, để dưới

đèn UV 30 phút cho đến khi môi trường đã nguội hoặc ở nhiệt độ khoảng 30 –

350C.

Bước 5: Bổ sung dịch giống vào môi trường nuôi cấy.

Bước 6: Cho dung dịch vào khay đựng hoặc bình tam giác và đậy kín lại

bằng vải xơ. Sau đó bắt đầu thực hiện q trình ni cấy tĩnh trong phòng kín.

Bước 7: Để khay đựng môi trường tạo màng vào nơi thống khí, có nhiệt

độ ổn định và khơng di chuyển dung dịch trong khay từ 6 – 14 ngày.

Bước 8: Tiến hành thu màng và xả sạch chúng dưới vòi nước.

2.3.2. Phương pháp xử lý màng VLC trước khi hấp thụ thuốc

Màng VLC sau khi thu được có màu trắng sữa, chứa nhiều nước, một

lượng lớn môi trường lên men và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất. Để

loại bỏ các tạp chất trong môi trường nuôi cấy và độc tố của vi khuẩn thì trước

khi hấp thụ thuốc cần xử lý màng.

Các bước tiến hành theo sơ đồ hình 2.1.



11

Footer Page 20 of 63.



Tài liu lun vn s phm 21 of 63.



Tách màng VLC

thơ

Rửa bằng nước cất

Bình 1000ml NaOH 0,3M

(10 – 20 màng d = 1,5cm)



Hấp trong 1130C, 15 phút



Xả nước 24 giờ



Thu VLC tinh khiết

Hình 2. 1. Sơ đồ quy trình thu nhận VLC tinh khiết



+ Trong màng VLC khi thu chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp vật

liệu trong NaOH 3% nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử

trùng HV – 110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội

độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1 giờ.

+ Sau khi ngâm trong NaOH, lấy vật liệu đặt dưới vòi nước xả đến khi vật

liệu chuyển sang màu trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra mơi trường bề mặt màng

VLC cần đạt là trung tính, ta thu được màng VLC tinh khiết.

2.3.3. Phương pháp dựng đường chuẩn của Berberine hydrochloride

Nguyên tắc: Sử dụng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 xác định lượng

thuốc Berberine hydrochloride trong màng VLC đã nạp thuốc.



12

Footer Page 21 of 63.



Tài liu lun vn s phm 22 of 63.



Dùng máy đo quang phổ UV – 2450 để đo vùng phổ tử ngoại và khả kiến.

Sử dụng hai cuvet được làm từ thạch anh đo dùng cho dung dịch thử và dung

dịch đối chiếu. Cuvet dùng để đo phải được làm sạch và thao tác cẩn thận.

Pha loãng dung dịch Berberine hydrochloride trong dung dịch cồn 96% ở

các nồng độ khác nhau: 5, 10, 20, 30, 40, 50 (mg/ml). Quét phổ dung dịch

Berberine hydrochloride có nồng độ 10 ml trong khoảng bước sóng từ 200 đến

800 nm. Sau đó, lựa chọn được bước sóng 345nm tại đó Berberine hydrochloride

được hấp thụ cực đại.

Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV- Vis 2450 để đo mật độ quang phổ

(OD) của dung dịch đã pha như trên ở bước sóng 345nm.

Thực hiện đo lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc

Berberine để xây dựng đường chuẩn.

Mật độ quang OD của dung dịch thuốc ở nồng độ khác nhau được thể hiện

ở bảng 2.2.

Bảng 2. 2. Mật độ quang OD của dung dịch Berberine hydrochloride ở các nồng độ

(mg/ml) khác nhau (n = 3)



Mật độ quang OD



Nồng độ



Giá trị trung



(Abs 345nm)



STT



bình



(mg/ml)

Lần 1



Lần 2



Lần 3



1



5



0,353



0,351



0,353



0,353 ± 0,002



2



10



0,691



0,720



0,719



0,710 ± 0,016



3



20



1,552



1,520



1,500



1,524 ± 0,2623



4



30



2,185



2,210



2,220



2,205 ± 0,018



5



40



3,017



2,980



3,015



3,004 ± 0,020



6



50



3,590



3,650



3,608



3,616 ± 0,030



13

Footer Page 22 of 63.



Tài liu lun vn s phm 23 of 63.



Sử dụng phần mềm Excel 2010 để xây dựng phương trình đường chuẩn và

dựng đồ thị biểu diễn. Kết quả lập được đồ thị như hình 2.2.



OD345nm

y = 0.0734x + 0.0056

R² = 0.9986



Giá trị OD trung bình



4

3.5

3

2.5

2



OD345nm



1.5



Linear (OD345nm)



1

0.5

0



0



20



40



60



Nồng độ thuốc Berberine hydrochloride (mg/ml)



Hình 2. 2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của dung dịch Berberine hydrochloride



Phương trình đường chuẩn:

Y = 0,0734x + 0,0056 (R2 = 0,9986)

Trong đó:

x: Nồng độ Berberine hydrochloride (mg/ml)

y: Mật độ quang OD tương ứng với nồng độ x

R2: Hệ số tương quan

2.3.4. Xác định khối lượng hấp thu thuốc vào màng VLC

Màng VLC được tạo ra từ ba loại môi trường nuôi cấy khác nhau: môi

trường chuẩn, môi trường nước dừa già và môi trường nước vo gạo. Sau khi tinh

chế, màng thu được sẽ được dập thành các viên dạng viên thuốc hình tròn với

đường kính d = 1,5cm và độ dày là 0,3cm và 0,5cm tương đối đều nhau. Đem

màng hấp thu thuốc Berberine hydrochloride theo các chỉ số thiết kế thí nghiệm:



14

Footer Page 23 of 63.



Tài liu lun vn s phm 24 of 63.



Hòa thuốc Berberine hydrochloride dạng tinh khiết vào dung dịch cồn

96%, sau đó cho màng VLC vào. Sau khoảng thời gian nhất định, lấy màng VLC

ra và xác định lượng thuốc được hấp thụ qua màng.

Lượng thuốc được hấp thụ qua màng VLC được xác định theo cơng thức:

mVLC = mVLC(1) – mVLC(2)

Trong đó:

mVLC là khối lượng thuốc hấp thụ qua màng VLC.

MVLC(1) là khối lượng của màng VLC ban đầu.

MVLC(2) là khối lượng của màng VLC sau khi hấp thụ thuốc.

Hiệu quả hấp thụ thuốc vào màng được tính theo cơng thức:

EE (%) =



x 100% (3)



Trong đó:

EE: Phần trăm nạp thuốc vào màng.

mht (mg/cm3): Khối lượng thuốc hấp thụ trong 1 đơn vị thể tích màng.

m0 (mg/cm3): Khối lượng thuốc trong 1 đơn vị thể tích ban đầu.

2.3.5. Phương pháp xử lý thống kê

Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần để lấy trung bình mẫu và phân tích thống kê

số liệu qua phần mềm Excel để phân tích phương sai và xác định khoảng tin cậy.

Tất cả các dữ liệu được trình bày theo giả định trung bình và độ lệch chuẩn

“MEAN + SD” [19].

Kiểm định giả thiết về giá trị trung bình của hai mẫu bằng cách sử dụng

hàm: t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variences với ý nghĩa α = 0,05.

Những khác biệt được coi là ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05.



15

Footer Page 24 of 63.



Tài liu lun vn s phm 25 of 63.



CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thu màng VLC thô và tạo màng VLC tinh khiết

Sau khoảng 10 - 14 ngày, thu màng VLC thơ có độ dày 0,3cm – 0,5cm từ

dịch nuôi cấy tĩnh lên men từ các môi trường khác nhau.

Kết quả cho thấy rằng màng VLC thu được từ các mơi trường ni cấy có

màu trắng sữa, dễ tách ra khỏi môi trường nuôi cấy và chứa nhiều nước. Bề mặt

màng của các loại môi trường chuẩn và môi trường nước dừa già mịn hơn màng

của môi trường nước vo gạo.

Màng VLC khi nuôi cấy tĩnh trong các môi trường: Môi trường chuẩn,

môi trường nước dừa già và môi trường nước vo gạo được thể hiện trong hình

3.1, 3.2 và 3.3.



Hình 3.1. Màng VLC ni cấy trong mơi trƣờng chuẩn



16

Footer Page 25 of 63.



Tài liu lun vn s phm 26 of 63.



Hình 3.2. Màng VLC ni cấy trong mơi trƣờng nƣớc dừa già



Hình 3. 3. Màng VLC ni cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo



17

Footer Page 26 of 63.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×