Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Hình 3.6: Đồ thị biễu diễn độ hấp thụ (A 280nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc kí lọc gel Sephacryl S-200

Hình 3.6: Đồ thị biễu diễn độ hấp thụ (A 280nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc kí lọc gel Sephacryl S-200

Tải bản đầy đủ - 0trang

Tiến hành tinh sạch lectin từ rong đỏ B. gelatinus bằng các thơng số thích hợp đã

được khảo sát. Qua từng bước tinh sạch, tiến hành xác định hàm lượng protein, hoạt độ

NKHC, hiệu suất và độ tinh sạch được thể hiện ở bảng 3.3.



Dịch chiết thô

Dịch sau kết

tủa

Dịch sau sắc kí

trao đổi ion

DEAEsepharose

Dịch sau sắc kí

lọc gel

Sephacryl S200



Protein tổng

(mg)



MAC

(mg/HU)



HĐTS

(HU)



HĐR

(HU/mg)



Độ tinh Hiệu suất

sạch

(%)



705.38



0.0192



36800



52.17



1



100



103.95



0.0090



11520



110.82



2.12



31.30



5.06



0.0027



1872



370.0



7.09



5.09



2.16



0.0017



1240



574.3



11.01



3.37



Bảng 3.3: Kết quả tinh sạch lectin từ rong đỏ B. gelatinus



Qua các bước tinh sạch, chúng ta nhận thấy, HĐTS cũng như protein tổng số

của chế phẩm thu được giảm đi đáng kể từ 36800 HU và 705,38 mg xuống còn 1240

HU và 2,16 mg tương ứng. Điều này có thể giải thích là do sự tổn thất và biến tính bất

thuận nghịch của một số phân tử protein trong suốt quá trình tinh sạch.

Kết quả từ bảng 3.3 cũng cho thấy, khi tủa protein bằng tác nhân cồn, HĐR của

protein lectin từ rong B. gelatinus tăng lên đáng kể. Sau khi tủa, HĐR của CPKT là



Rong B. gelatinus



110,82 HU/mg trong khi DC thơ chỉ có HĐR là 52,17 HU/mg vì quá trình tủa đã loại

bớt được một số tạp chất.

Sau đó, qua q trính sắc kí trao đổi ion và sắc kí lọc gel, ta sẽ thu được những

Xay nhuyễn

-Dung mơi

Ethanolcó20%

phânchiết

tử protein

hoạt độ NKHC và loại bỏ được các protein không thể hiện hoạt độ

-Tỉ lệ nguyên

môi

1:6sau

w/v

NKHCliệu-dung

nên HĐR

củachiết

lectin

khi tinh

sạch

và hệ số tinh sạch ở giai đoạn này đều

Chiết

lectin

-Thời gian chiết: 4 giờ

cao

nhất4oC

(HĐR 574,3 HU/mg; hệ số tinh sạch 11,01 lần).

Nhiệt độ

chiết:

- Nồng độ EtOH 70%

Kết quả này cũng được minh chứng rõ hơn, khi nồng độ protein nhỏ nhất có thể

Kết tủa lectin

- Thời gian tủa: 4 giờ

tạo nên 1 đơn vị hoạt độ NKHC cũng giảm dần qua các bước -tinh

sạch:

MAC

ở dịch

Nhiệt

độ tủa:

4oC

Sắc kí trao đổi ion

thơ là 0,0192 mg/HU; sau khi tủa giảm

còn 0,009 mg/HU và sau khi sắc ký lọc gel giá

DEAE-sephadex

trị này chỉ còn 0,0017 mg/HU.

Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tơi đưa ra quy trình cơng nghệ thu

lọc gel

nhận lectin từ rong B. gelatinus cụ thể Sắc

nhưkýsau:

Sepharyl S-200

51



Lectin



Hình 3.7: Sơ đồ quy trình cơng nghệ thu lectin từ rong B. gelatinus





Giải thích quy trình

Mẫu rong biển Betaphycus gelatinus được rửa sạch, xay nhuyễn thành bột mịn



bằng cối xay inox có bổ sung Nitơ lỏng.

Mẫu rong được chiết bằng dung môi ethanol 20% với tỷ lệ nguyên liệu : dung

môi (w/v) 1:6 ở nhiệt độ 4oC trong 4 giờ. Thu hồi dịch chiết bằng bộ lọc thô để loại

cặn lẫn trong DC, sau đó li tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu phần dịch trong

chuẩn bị cho quá trình tinh sạch.

Dịch chiết thô lectin được tủa bằng tác nhân ethanol 70% với nhiệt độ tủa 4oC

và để trong khoảng thời gian 4 giờ. Sau đó, tiến hành ly tâm lạnh ở 4 oC với tốc độ

6000 vòng/phút trong 30 phút để thu phần kết tủa. Hòa tủa bằng dung dịch đệm PBS

(0,02M; NaCl 0,15M; pH 7,5) và thẩm tích trong dung dịch PB (0,02M; pH 7,5) để

loại bỏ muối.

Dịch tủa sau thẩm tích được li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút, thu

phần dịch trong. Dịch trong được bơm vào cột trao đổi ion DEAE-Sepharose, tiến

hành chạy sắc kí trao đổi ion với tốc độ dòng 10 ml/phút. Sử dụng pha động là dung

dịch đệm PB (0,02M; pH 7,5) (de gas) để rửa giải các protein và màu không liên kết ra

khỏi cột, đến khi đo A 280nm bằng 0. Sau đó, dùng pha động là dung dịch đệm PBS

(0,02M; NaCl 0,5M; pH 7,5) (de gas) để rửa giải các protein liên kết với cột. Tiến

hành đo A 280nm và xác định hoạt tính NKHC của từng phân đoạn. Thu lại các phân

đoạn có hoạt tính NKHC.

52



Các phân đoạn có hoạt tính NKHC được cơ đặc bằng phương pháp siêu lọc và

thẩm tích trong đệm PBS (0,02M; NaCl 0,15M, pH 7) ở 4 oC và để qua đêm, nhằm cân

bằng nồng độ muối và pH. Dịch sau thẩm tích được li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút

trong 30 phút, thu phần dịch trong.

Dịch trong được bơm vào cột gel Sephacryl S-200, tiến hành chạy sắc kí lọc gel

với tốc độ 0,8 ml/phút, sử dụng pha động là dung dịch đệm PBS (0,02M; NaCl 0,15M;

pH 7) (de gas) để rửa giải cột. Mỗi phân đoạn thu 2,5 ml. Tiến hành đo A 280nm và

xác định hoạt tính NKHC của từng phân đoạn. Thu lại các phân đoạn có hoạt tính

NKHC.

Các phân đoạn có hoạt tính NKHC được cơ đặc bằng phương pháp siêu lọc.

Chúng ta đã tinh sạch và thu được dịch lectin.



53



3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ, HÓA VÀ SINH HỌC CỦA

LECTIN TỪ RONG ĐỎ B. GELATINUS

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ B.

gelatinus.

Để khảo sát nhiệt độ thích hơp của lectin từ rong B. gelatinus, lectin sẽ được ủ

ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 10 oC đến 100oC trong vòng 30 phút, sau đó làm lạnh

nhanh và xác định hoạt độ NKHC của lectin với hồng cầu thỏ đã xử lý trypsin. So sánh

kết quả với hoạt độ NKHC của dịch chiết thô.

Kết quả được trình bày trong bảng PL 7 và hình 3.8.

Hình 3.8 : Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ B.

gelatinus



Từ kết quả hình 3.8, ta thấy ở nhiệt độ 50oC HĐTS của lectin vẫn đạt giá trị cực

đại. Nhưng khi nhiệt độ vượt quá 50oC thì hoạt độ NKHC bắt đầu giảm dần. Ở nhiệt

độ 90oC, HĐTS chỉ còn 2 HU và mất đi hoàn toàn khi nhiệt độ tăng đến 100 oC.

Nguyên nhân là do khi nhiệt độ tăng cao đã làm đứt gãy một số liên kết yếu trong phân

tử lectin, đặc biệt là cấu trúc trung tâm hoạt động của lectin, làm nó mất hoạt tính

NKHC.

Theo nghiên cứu của Stelio và cộng sự, khi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong Pterocladiella capillacea, hoạt độ vẫn đạt được

giá trị cực đại ở nhiệt độ 600C và chỉ mất hoàn toàn hoạt độ khi nhiệt độ tăng lên 80 oC.

Trong khi đó, khi nghiên cứu về 2 loài rong là Codium fragile và Hypnea japonica,

Hori cũng nhận thấy hoạt độ NKHC của chúng vẫn không bị ảnh hưởng ở mức nhiệt

độ rất cao là 80oC.

Khả năng chịu nhiệt là một trong những điểm khác biệt đặc trưng giữa lectin từ

rong biển so với lectin từ thực vật bậc cao và động vật. Nhiều nghiên cứu cho thấy,

hoạt độ NKHC của lectin từ thực vật bậc cao hay động vật bị ảnh hưởng khá mạnh bởi

nhiệt độ. Theo kết quả nghiên cứu của TS. Trương Văn Châu, ở mức nhiệt độ 60 oC thì

hoạt độ NKHC của lectin từ mít na đã giảm hơn 50% và mất hoàn toàn ở 70oC [1].

Theo kết quả nghiên cứu của luận văn này cho thấy, cũng giống như một số

lectin từ rong biển khác, lectin từ rong B. gelatinus là một lectin khá bền nhiệt.

Khả năng chịu nhiệt tốt của lectin từ rong B. gelatinus sẽ là một yếu thuận lợi

cho việc nghiên cứu cũng như ứng dụng lectin này trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ B. gelatinus.



54



Kết quả xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong B.

gelatinus được trình bày trong bảng PL 8 và hình 3.9.

Hình 3.9 : Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ B. gelatinus



Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt độ NKHC của lectin từ rong B. gelatinus

không hề bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi của pH, ở cả 3 mơi trường axit, kiềm và trung

tính.

Đây là một tính chất khá thú vị của lectin từ rong B. gelatinus và tính chất

này cũng đã được nhận thấy ở một số loài rong khác như Ulva pertusa hoạt động tốt

trong khoảng pH từ 3 đến 10, hay rong Enteromorpha linza không thay đổi hoạt độ

trong khoảng pH từ 4 đến 10. Các nghiên cứu trên cũng tương đồng với kết quả trong

nghiên cứu của TS. Lê Đình Hùng cùng cộng sự vào năm 2012, khi tiến hành khảo sát

sự ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của 8 loài rong thuộc vùng biển Ninh Thuận,

Việt Nam. Kết quả từ nghiên cứu trên cho thấy, hầu hết hoạt độ NKHC của các lectin

này đều không bị ảnh hưởng bởi pH, tiêu biểu như rong Boodlea composite và rong

Dictyosphaeria versluysii hoạt độ của chúng không thay đôi trong khoảng pH từ 4 đến

9.



55



KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

 KẾT LUẬN



Từ những kết quả thu qua các thí nghiệm của đề tài, chúng tơi xin rút ra kết

luận cho quy trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát một số tính chất của lectin từ rong

B.Gelatinus như sau:

1. Các điều kiện thích hợp để chiết lectin từ rong B. gelatinus:



Dung mơi chiết: Ethanol 20%



Tỷ lệ ngun liệu : dung mơi (w/v): 1:6



Thời gian chiết: 4 giờ



Nhiệt độ chiết: 4oC

2. Tinh sạch lectin bằng phương pháp kết tủa với ethanol, nồng độ Ethanol 70%, nhiệt

độ 4oC, thời gian 4 giờ. Sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose thu được dịch lectin

có HĐTS 1872 HU, HTR 370,0 HU/mg, MAC 0,0027 mg/HU, hiệu suất thu hồi

5,09 %, độ tinh sạch 7,09 lần. Sắc kí lọ gel Sephacryl S-200 thu được dịch lectin

có HĐTS 1240 HU, HĐR 574,3 HU/mg, MAC 0,0017 µg/HU, hiệu suất thu hồi

3,37 % và độ tinh sạch 11,01 lần.

3. Nghiên cứu bước đầu xác định một số tính chất đặc trưng của lectin từ rong B.





gelatinus bao gồm:

Lectin này khá bền nhiệt, khoảng nhiệt độ hoạt động dưới 50oC.



Hoạt tính NKHC khơng thay đổi từ vùng pH 3 đến 10.

 KIẾN NGHỊ

Để sản phẩm lectin có khả năng ứng dụng, chúng tơi có những kiến nghị sau đây:

1. Đánh giá một số hoạt tính sinh học của lectin thu được từ rong B. gelatinus.

2. Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm lectin sau khi tinh sạch

3. Nghiên cứu, phát triển ứng dụng chế phẩm lectin từ rong B. gelatinus trong các



lĩnh vực y học, nông nghiệp và một số lĩnh vực khác.



56



TÀI LIỆU THAM KHẢO



[1].



Tài liệu Tiếng Việt



Trương Văn Châu (2004), “Một số tính chất hóa sinh của Lectin mít na”, tạp chí

khoa học-ĐHSP Hà Nội, 4, pp.83-87.



[2].



Đỗ Ngọc Liên, Trần Tuấn Quỳnh (1991), “Tách tinh chế và một số tính chất của

Lectin từ hạt chay A. tonkinensis”, Tạp chí khoa học, 13(2), pp. 20-27.



[3].



Nguyễn Đức Lượng và các cộng sự (2004), “Công nghệ enzyme”, Nhà xuất bản

Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 534 trang.



[4].



Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa, “Chế biến

rong biển”, Giáo trình Đại học Nha Trang.



[5].



Lê Thanh Mai và các cộng sự (2006), “Các phương pháp phân tích ngành cơng

nghệ lên men”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 332 trang.



[6].



Nguyễn Thị Thịnh, Lê Doãn Diên, Nguyễn Quốc Khang và Phan Huy Bảo (1983),

“Kết quả điều tra Lectin ở một số giống đậu ở Việt Nam”, Tạp chí sinh học, 5(4),

pp.11-18.



[7].



Đặng Thị Thu và các cộng sự (2003), “Công nghệ enzyme”, Nhà xuất bản Khoa

học và kỹ thuật, Hà Nội, 304 trang.



[8].



Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Xuân

Sâm, Lê Ngọc Tú, Đỗ Hoa Viên (2009), “Cơ sở công nghệ sinh học_Tập 2: Cơng

nghệ hóa sinh”, NXB Giáo dục Việt Nam, Đà Nẵng.





[9].



Tài liệu Tiếng Anh



Allen, N. K and Brillantine L. (1969), “A survey of hemagglutinins in various

seeds”, J. Immunol, 102, pp. 1295-1299.



[10].



Austin B. and Zhang H. (2006), “Vibrio harveyi: a significant path gen of marine

vertebrates and invertebrates”, Letters in applied Microbiology, 43(2), pp. 119-214.



[11].



Balcht, Aldona & Smith, Raymond (1994), “Pseudomonas aeruginosa: Infections

and Treatment”, Informa Health Care, pp. 83–84.



[12].



Balzarini et al (1991), “Alpha-(1-3)- and alpha-(1-6)-D-mannose- specific plant

lectins are markedly inhibitory to human immunodeficiency virus and



57



cytomegalovirus infections in vitro”, Antimicrob Agents Chemother, 35(3), pp.

410-6.

[13].



Barnes B.J., Wiederhold N.P., Micek S.T., Polish L.B., Ritchie D.J.

(2003),"Enterobacter cloacae ventriculitis successfully treated with cefepime and

gentamicin: case report and review of the literature", Pharmacotherapy, 23(4),

pp.537–42.



[14].



Barondes S.H., Cooper D.N., Gitt M.A., Leffler H. (1994), “Galectin: Structure and

function of a large family of animal lectin”, J. Biol. Chem., 269, 20807-10.



[15].



Bartolomeu Warlene S. de Souza et al (2007), “A survey of Antarctic algae for

agglutinins”, Oecol. Bras., 11(1), pp. 122-130.



[16].



Basilio J. Anía, M.D. (2007), "Serratia", eMedicine.



[17].



Benevides N. M. B., Holanda M. L., Melo F. R., Freitas A. L. P. and Sampaio A. H.

(1998), “Purification and Partial Characterisation of the Lectin from the Marine

red alga Enantiocladia duperreyi (C. Agardh) Falkenberg”, Botanica Marina, vol

41, pp. 521-525.



[18].



Boyd W.C., Almodavar L.R., Boyld L.G. (1966), “Agglutinins in marine algae for

human erythrocytes”, Transfusion (Philadelphia), 6, pp.82-83.



[19].



Calvete J. J., Costa F. H. F., Saker S. S., Murciano M. P. M., Nagano C. S., Cavada

B. S., Grangeiro T. B., Ramos M. V., Bloch C., Freitas B. T. and Sampaio A. H.

(2000), “The amino acid sequence of the agglutinin isolated from the red marine

alga Bryothamnion triquetrum defines a novel lectin structure”, CMLS. Cell. Mol.

Life Sci., 57, pp. 343-350.



[20].



Doty, M.S. (1988), “Prodromus ad systematica Eucheumatoideorum: Atribe of

commercial seaweeds related to Eucheuma (Solieriaceae, Gigartinales)”, In:I.A.

Abbott (Ed.), Volume II, California, pp. 159-207.



58



PHỤ LỤC

Bảng PL 1: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml)



Nồng độ BSA (µg/ml)



OD750nm



20



0,053



40



0,112



80



0,209



120



0,309



160



0,401



200



0,478



Bảng PL 2: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin



Dung môi



Thể

tích

(ml)



HA

(HU/ml

)



Protein

tổng (mg)



MAC

(mg/HU)



HĐTS

(HU)



HĐR

(HU/mg)



Nước cất



4



32



5.065



0.040



128



25.3



EtOH 10%



4



32



4.994



0.039



128



25.6



EtOH 20%



4



64



4.641



0.018



256



55.2



EtOH 30%



4



64



5.206



0.020



256



49.2



PBS



4



64



5.524



0.022



256



46.3



59



Bảng PL 3: Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) đến HĐTS và HĐR của

lectin



Tỉ lệ



Thể tích

(ml)



HA

(HU/ml)



Protein tổng

(mg)



MAC

(mg/HU)



HĐTS

(HU)



HĐR

(HU/mg)



1:04



4



32



3.051



0.024



128



42.0



1:06



6



64



6.644



0.017



384



57.8



1:08



8



32



15.428



0.060



256



16.6



1:10



10



16



21.868



0.137



160



7.3



Bảng PL 4: Ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến HĐTS và HĐR của lectin



Thời gian

(giờ)



Thể

tích

(ml)



HA

(HU/ml)



Protein tổng

(mg)



MAC

(mg/HU)



HĐTS

(HU)



HĐR

(HU/mg)



2



6



32



6.564



0.034



192



29.3



4



6



64



7.3605



0.019



384



52.2



6



6



64



11.3325



0.030



384



33.9



8



6



64



14.9085



0.039



384



25.8



60



Bảng PL 5: Kết quả đo A 280nm và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau sắc kí trao đổi

ion DEAE-Sepharose.



Số ống



OD



HA



1



0



0



2



0



0



3



0.199



0



4



0.302



0



5



0.204



0



6



0.148



0



7



0.09



0



8



0.06



0



9



0.037



0



10



0.024



0



11



0.017



0



12



0.012



0



13



0.013



0



14



0.012



0



15



0



0



16



0



0



17



0



0



18



0



0



Số ống



OD



HA



19



0



0



20



0



0



21



0



0



22



0.005



0



23



0.083



4

61



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Hình 3.6: Đồ thị biễu diễn độ hấp thụ (A 280nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc kí lọc gel Sephacryl S-200

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×