Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ EtOH (%)

Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ EtOH (%)

Tải bản đầy đủ - 0trang

những protein nào liên kết yếu với cột sẽ bị đẩy ra trước, còn những protein liên kết

chặt hơn sẽ bị đẩy ra ở nồng độ muối cao hơn

Dịch lectin thơ được tinh chế bằng sắc kí trao đổi ion DEAE-sepharose với các

thông số được thiết lập như sau:

- Gel: DEAE-Sepharose

- Kích thước cột: 1,6 x 20 cm

- Đệm: PB (0,02M; pH 7,5) (de gas) ; PBS (0,02M; NaCl 0,2M; pH 7,5) (de gas)



Thể tích mẫu: 6ml



-



- Tốc độ dòng: 10 ml/phút

- Thể tích mỗi phân đoạn: 10 ml/phân đoạn

- Số lượng phân đoạn: 36 phân đoạn

- Tổng thể tích rửa giải: 360 ml



Xác định hoạt tính NKHC của các phân đoạn, từ đó thu nhận các phân đoạn có

hoạt tính và tiến hành cơ đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa

Vẽ đồ thị biễu diễn sự tương quan giá trị A 280 nm, hoạt độ NKHC và thứ tự các

phân đoạn.

2.3.7. Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S-200

Hệ thống sắc kí lọc gel gồm pha cố định là một loại gel có cấu tạo dạng mạng

lưới (rây) và lỗ rây. Kích thước của các lỗ rây này là khác nhau tùy theo loại gel sử

dụng. Còn pha động là đệm hay một loại dung mơi thích hợp. Các chất khi đi qua hệ

thống lọc gel sẽ được phân tách theo ngun tắc: các phân tử có kích thước to hơn kích

thước lỗ rây, khơng thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng sẽ len qua phần kẽ hở giữa các

hạt gel và nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột. Còn các phân tử

có kích thước phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ rây sẽ tồn phần hoặc bán toàn phần lọt

vào lỗ rỗng, cuối cùng theo dòng chảy ra khỏi cột.

Sephacryl S-200 có khả năng phân tách những protein có kích thước 5x10 32,5x105 Da.

Dịch lectin sau khi khi tinh sạch bằng sắc kí trao đổi ion được thẩm tích trong

đệm PB (0,02M pH 7,5) và tiến hành tinh sạch bằng kĩ thuật sắc khí lọc gel với các

thông số được thiết lập như sau:

-



Gel: Sephacryl S-200

Kích thước cột: 1,6 x 60 cm.

44



-



Đệm: PBS (0,02M, NaCl 0,15M, pH 7) (đã loại khí)

Thể tích mẫu: 0,5 ml

Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

Thể tích mỗi phân đoạn: 2,5 ml/phân đoạn

Số lượng phân đoạn: 40 phân đoạn



Xác định hoạt tính NKHC của các phân đoạn, từ đó thu nhận các phân đoạn có

hoạt tính và tiến hành cơ đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa.

Vẽ đồ thị biễu diễn sự tương quan giá trị A 280 nm, họat độ NKHC và thứ tự các

phân đoạn.



45



2.3.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các tác nhân: nhiệt độ, pH đến hoạt tính



NKHC của lectin từ rong đỏ B. gelatinus.

 Khảo sát nhiệt độ hoạt động thích hợp

Cho 0,5 ml mẫu dung dịch lectin vào ống nghiệm, ủ ở các nhiệt độ khác nhau:

40, 50, 60, 70, 80, 90, 100oC trong 30 phút, sau đó làm lạnh nhanh. Mẫu được đem xác

định lại hoạt tính NKHC và so sánh với hoạt tính NKHC của mẫu ban đầu để xác định

ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong đỏ B. gelatinus.

 Khảo sát pH hoạt động thích hợp

Cho 0,5 ml mẫu dung dịch lectin thẩm tích trong các mức pH khác nhau: 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10 ở nhiệt độ 4 oC. Sau đó, thẩm tích ngược lại với dung dịch NaCl 0,15M

trong 4 giờ để loại các pH dư trong mẫu. Phần dịch trong túi thẩm tách được li tâm với

tốc độ cao 10000 vòng/phút trong 5 phút. Phần dịch trong được xác định hoạt tính

NKHC và so sánh với hoạt tính NKHC của mẫu ban đầu để xác định ảnh hưởng của

pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong đỏ B. gelatinus.



46



CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT LECTIN TỪ RONG ĐỎ B.

GELATINUS

3.1.1 Ảnh hưởng của dung môi đến hoạt độ NKHC của lectin có trong rong đỏ B.

gelatinus.

Kết quả ảnh hưởng của dung môi đến hoạt độ tổng số và hoạt độ riêng của lectin

có trong rong đỏ B. gelatinus được thể hiện ở bảng PL 2 và hình 3.1.

Hình 3.1: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin



Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi sử dụng dung dịch đệm ethanol 20%, ethanol

30% và PBS (0,02M, NaCl 0,15M, pH 7,5) làm dung môi chiết, HĐTS không thay đổi

nhưng HĐR lại thay đổi rõ rệt (lần lượt là 256 HU, 55,2 HU/mg ; 256 HU, 49,2

HU/mg và 256 HU, 46,3 HU/mg) và đều cao hơn nhiều so với nước cất và ethanol

10% (lần lượt là 128 HU, 25,3 HU/mg và 128 HU, 25,6 HU/mg). Điều này có thể do

dung dịch đệm PBS 0,02M đảm bảo được điều kiện pH của môi trường, phù hợp với

khả năng khuếch tán protein; trong khi ethanol là một dung môi phân cực mạnh, có

khả năng làm tăng sự khuếch tán của protein lectin ra ngoài DC, làm tăng HĐTS và

HĐR của lectin.

Tuy nhiên, trong trường hợp này chúng tôi chọn dung mơi ethanol 20% cho các

nghiên cứu tiếp theo vì việc sử dụng ethanol có nhiều thuận lợi, nhiệt độ bay hơi của

ethanol thấp nên dễ tách bỏ dung môi này ra khỏi DC, làm tăng hiệu suất thu hồi DC

qua các bước tinh sạch tiếp theo, lượng ethanol dư thừa có thể được thu hồi để tái sử

dụng cho các mục đích khác.

3.1.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:dung mơi chiết đến hoạt độ NKHC của

lectin có trong rong đỏ B. gelatinus.

Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:dung môi chiết đến hoạt độ tổng số và

hoạt độ riêng của lectin có trong rong đỏ B. gelatinus được thể hiện ở bảng PL 3 và

hình 3.2.

Hình 3.2: Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của

lectin



Từ thí nghiệm trên, có thể nhận thấy thể tích dung mơi dùng để tách chiết có

ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết và hoạt độ NKHC của DC từ rong B. gelatinus.



47



Nhìn chung, khi tăng thể tích dung dịch đệm EtOH 20% từ 1:04 lên 1:06 thì

HĐTS tăng (từ 128 HU lên 384 HU) và HĐR cũng tăng dần (từ 42 HU/mg lên 57,8

HU/mg). Vì lúc này quá trình khuếch tán của protein lectin vào trong dung dịch đệm

cũng tăng lên, làm tăng khả năng NKHC, nên HĐTS và HĐR đều tăng. Tuy nhiên, nếu

tiếp tục tăng thể tích tỷ lệ ngun liệu : dung mơi (w/v) lên 1:08 và 1:10 thì hoạt độ

NKHC lại giảm, vì lúc này một lượng protein không phải lectin cũng sẽ khuếch tán ra

ngoài và làm ảnh hưởng đến hoạt độ NKHC của DC nên HĐTS và HĐR đều giảm

(HĐTS lần lượt là 256 HU và 160 HU; HĐR lần lượt là 16,6 HU/mg và 7,3 HU/mg).

Kết quả từ hình 3.2 cho ta thấy, ở tỷ lệ nguyên liệu : dung mơi (w/v) là 1:6 thì

HĐTS và HĐR đều đạt cực đại (384 HU và 57,8 HU/mg). Vì vậy chúng tơi chọn tỷ lệ

1:6 là tỉ lệ thích hợp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến hoạt độ NKHC của lectin có trong

rong đỏ B. gelatinus.

Kết quả ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến hoạt độ tổng số và hoạt độ riêng

của lectin có trong rong đỏ B. gelatinus được thể hiện ở bảng PL 4 và hình 3.3.

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến HĐTS và HĐR của lectin



Kết quả từ bảng PL 4 và hình 3.3 cho thấy, sau khi chiết 2 giờ, protein lectin

chưa khuếch tán nhiều ra ngồi dung mơi nên HĐTS và HĐR còn thấp (lần lượt là 192

HU và 29,3 HU/mg). Đến 4 giờ, HĐTS của lectin đạt cực đại và không thay đổi (384

HU) so với các dịch chiết trong 6 giờ và 8 giờ; HĐR cũng đạt cực đại tại 4 giờ (52,2

HU/mg) nhưng bắt đầu có xu hướng giảm dần khi cho chiết qua đến giờ thứ 6 (33,9

HU/mg). Qua giờ thứ 8, HĐR của lectin giảm đáng kể (25,8 HU/mg) vì thời gian chiết

càng dài, các protein khơng phải lectin khuếch tan ra dung dịch nhiều hơn nên lượng

protein tổng cao dẫn đến HĐRgiảm.

Vì vậy, để tiết kiệm thời gian, chi phí và đạt hiệu quả chiết cao nhất chúng tôi sẽ

chọn thời gian chiết là 4 giờ là khoảng thời gian chiết thích hợp để tiến hành các thí

nghiệm tiếp theo.

3.2 KẾT QUẢ TINH SẠCH LECTIN TỪ RONG ĐỎ B. GELATINUS

3.2.1. Khảo sát nồng độ Ethanol để kết tủa lectin

Kết quả xác định HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của CP lectin kỹ thuật được

trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.4.



48



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ EtOH (%)

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×