Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

Mẫu máu được rửa từ 3-5 lần. Sau đó, được định mức lên 50 ml dùng dung dịch

đệm PBS (0,02 M; NaCl 0,15M). Huyền phù HC 2% được dùng như HC tự nhiên.

Hồng cầu xử lý trypsin được chuẩn bị như sau: 1/10 thể tích của dung dịch

trypsin 0,5% (w/v) được cho vào huyền phù HC tự nhiên 2% (v/v). Hỗn hợp được ủ ở

37oC trong vòng 60 phút. Sau khi ủ, hồng cầu được rửa bằng dung dịch đệm PBS (0,02

M; NaCl 0,15M) từ 3 đến 5 lần và hòa lại bằng đệm PBS (0,02 M; NaCl 0,15M), ta thu

được dịch hồng cầu 2% đã xử lí enzyme.

 Tiến hành:



Cho 25µl PBS (0,02 M; NaCl 0,15M, pH 7,2) vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng

chữ V

Thêm 25µl mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ ngưng kết hồng cầu vào giếng

đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha là 1/2 n (n: số lần

pha lỗng).

Tiếp tục cho 25µl hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin vào tất cả các giếng.

Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 1 giờ, đọc kết quả.





Đọc kết quả:

Kết quả âm tính: tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ.

Kết quả dương tính: hồng cầu trong giếng bị ngưng kết hơn 50%.

 Đơn vị hoạt độ



1 đơn vị hoạt độ lectin hay 1 đơn vị hoạt độ NKHC viết tắt là HA (hemagglutinin

assay) trên 1 ml (HU/ml) chính là giá trị nghịch đảo của độ pha lỗng lớn nhất mà dịch

lectin còn có khả năng làm ngưng kết hơn 50% lượng hồng cầu cho vào phản ứng.



35



 Hoạt độ lectin



Hoạt độ tổng (Utổng): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất định.

Đơn vị: HU

Trong đó:



Utổng = V. 2n

V: tổng thể tích (ml)

n: số lần pha lỗng



Hoạt độ riêng (Uriêng): là số đơn vị hoạt độ lectin có trong 1mg protein.

Đơn vị: HU/mg

Trong đó:



2.3.2



Utổng: tổng số đơn vị hoạt tính.

Proteintổng: tổng hàm lượng protein.

Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951)

Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự năm



1951 [5], dùng Albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất

chuẩn.

 Nguyên tắc



Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở phức chất Cu-protein khử hỗn hợp

Photphomolipden Phophovonphramat (thuốc thử Folin-ciocaltue) tạo phức chất có

màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi

nhất định. Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bước sóng 750nm.

Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein cần phân

tích.

 Hóa chất



Dung dịch A: NaOH (0,1M) + Na2CO3 (2%)

Dung dịch B: CuSO4.5H2O (0,5%) + Sodium citrate (1%)

Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 50:1 (pha trước khi sử

dụng).

Thuốc thử Folin: pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng.

Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/ml.

 Các bước tiến hành



Cân 10mg BSA hòa tan trong 10ml nước cất, ta được dung dịch gốc có nồng độ

1mg/ml. Sau đó, pha lỗng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 60,

80, 100 và 120µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.

Lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào ống

nghiệm, thêm vào đó 2,5ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó, thêm

36



vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và

để yên trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước

sóng 750nm.

Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi

quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thơng thường.

Hình 2.1: Đường chuẩn protein theo phương pháp của Lowry



Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị và tiến hành bổ sung các hóa chất như đã

nêu trên. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để

tính giá trị protein. Làm thí nghiệm với mẫu kép và lấy giá trị trung bình.



2.3.3. Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ rong biển

 Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát





Rong B.

gelatinus



Xay nhuyễn

Chiết

Lọc, ly tâm





Dịch chiết

Kết tủa

Ly tâm

Tủa



Dịch



Khảo sát:

-Dung môi chiết

-Tỉ lệ ngun liệu-dung

mơi chiết (w/v)

-Thời gian chiết (giờ)



Thẩm tích

Sắc kí trao đổi ion

DEAE-sephadex

Sắc ký lọc gel

Sepharyl S-200

37



Khảo sát:

-Nồng độ EtOH (%)



Lectin



Xác định:

-Ảnh hưởng nhiệt độ

-Ảnh hưởng của pH



Hình 2.2: Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát thu nhận lectin từ rong biển



38



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×