Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN LECTIN

5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN LECTIN

Tải bản đầy đủ - 0trang

Phương pháp thẩm tích được tiến hành dựa trên nguyên lý sử dụng màng bán

thấm với đặc tính cho qua những phần tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phần tử lớn.

Trong phương pháp này, màng bán thấm ở dạng túi chứa chất cần thẩm tích đặt trong

mơi trường có pH nhất định, các phân tử nhỏ trong túi sẽ khuếch tán ra mơi trường

ngồi nhờ tác động của máy khuấy từ. Thẩm tích thường dùng để loại muối và những

chất phân tử nhỏ không phải protein ra khỏi dung dịch chứa lectin cần thẩm tích.

1.5.2



Các kỹ thuật tinh chế lectin

 Sắc ký trao đổi ion

Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích. Tùy thuộc vào

pH của mơi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm. Lợi dụng tính chất này

người ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin. Các chất nhựa gắn các

nhóm chứa ion tích điện dương như DEAE-sephadex, DEAE-xenluloza, DEAEtrisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi anion. Các chất nhựa gắn các nhóm chức

ion tích điện âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl…được sử dụng làm

chất trao đổi cation.

Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa

vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện

môi trường pH nhất định.

 Sắc ký lọc gel



Đây là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thước

phân tử. Chất giá thường được sử dụng là Sephadex. Mỗi hạt Sephadex có bản chất là

polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lưới xốp. Có nhiều loại

Sephadex, trong đó mỗi loại có mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thước của lỗ

xốp khác nhau. Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất có

kích thước phân tử khác nhau. Để tinh chết lectin, người ta thường dùng loại Sephadex

G-75 và Sephadex G-100.

Phương pháp sắc ký lọc gel còn được dùng để xác định khối lượng phân tử của

chất cần tách.



31



 Sắc ký ái lực



Nguyên tắc của phương pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu

của lectin với một phân tử khác gọi là chất kết hợp (ligand) được gắn vào một chất giá

tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký. Chất giá được sử dụng nhiều nhất là một số loại gel:

Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel….Quá trình thực hiện sắc ký ái lực được

tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột ái lực với lectin, giai đoạn 2 là gắn hay

hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực.

Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp

phụ, tốc độ dòng chảy.



32



CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU



Đối tượng nghiên cứu: Rong đỏ B. gelatinus thu ở vùng biển Ninh Thuận

-Khánh Hòa.

Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang - Tp.

Nha Trang - Tỉnh Khánh Hòa.

2.2

2.2.1



VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

Vật liệu

Mẫu rong B. gelatinus thu ở vùng biển Ninh Thuận - Khánh Hòa, sau khi thu



rong được giữ lạnh và chuyển về phòng thí nghệm. Rong được xay nhỏ trong Nitơ

lỏng và cho vào các túi nilong (25 x 35 cm), cho vào tủ đông -20oC để bảo quản.

Hồng cầu của máu thỏ lấy từ Viện Vaccine - Nha Trang.

2.2.2



Hóa chất

BSA ( Bovine serium albumin) (Đức)

Enzyme Trypsin (Sigma – USD)

Thuốc thử Folin (Merck – Đức)

Hóa chất phân tích các loại: NaCl, CuSO 4.5H2O, NaH2PO4, Na2HPO4,



(NH4)2SO4, NaOH, Na2CO3 … (Trung Quốc)

DEAE-sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala – Thụy Điển)

Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala – Thụy Điển)



2.2.3



Thiết bị nghiên cứu



Bảng 2.1: Các thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm

33



Thiết bị



Model máy, vật liệu,

dung tích



Xuất sứ



Bể siêu âm



UTRASONIC



Hàn Quốc



Bộ siêu lọc



Toyo-Roshi, UHP-43



Nhật



Cột sắc kí lọc gel



1,6 x 60 cm



GE healthecare Sweden



Cột sắc kí trao đổi ion



1,6 x 20 cm



GE healthecare Sweden



Frac-920



GE healthecare Sweden



Khay 96 giếng đáy chữ V



Polystyrene



Greiner-Đức



Máy đo pH



827pH Lab



Metrohm-Thụy Sỹ



Máy đo quang Spectro UV



2505/24RS



Labomed



Máy khuấy từ



C-MAGHS-7



Hettich-Đức



Máy li tâm



EBA20



Hettich-Đức



Máy li tâm eppendorf



5417R



Eppendorf-Đức



Máy Vortex



BV1000



Greiner-Nhật



Micropipet



2-20 µl



Nichiryo-Nhật



Micropipet



20-200 µl



Nichiryo-Nhật



Micropipet



100-1000 µl



Nichiryo-Nhật



Micropipet



1-10 ml



Nichiryo-Nhật



Micropipet 8 ỗ



5-50 µl



Nichiryo-Nhật



Hệ thống bơm và thu nhận

phân đoạn



2.3

2.3.1



PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu

Hồng cầu được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt độ NKHC của



lectin là hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin.

 Chuẩn bị huyền phù hồng cầu (HC) 2%

34



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN LECTIN

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×