Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

Thiết bị



Model máy, vật liệu,

dung tích



Xuất sứ



Bể siêu âm



UTRASONIC



Hàn Quốc



Bộ siêu lọc



Toyo-Roshi, UHP-43



Nhật



Cột sắc kí lọc gel



1,6 x 60 cm



GE healthecare Sweden



Cột sắc kí trao đổi ion



1,6 x 20 cm



GE healthecare Sweden



Frac-920



GE healthecare Sweden



Khay 96 giếng đáy chữ V



Polystyrene



Greiner-Đức



Máy đo pH



827pH Lab



Metrohm-Thụy Sỹ



Máy đo quang Spectro UV



2505/24RS



Labomed



Máy khuấy từ



C-MAGHS-7



Hettich-Đức



Máy li tâm



EBA20



Hettich-Đức



Máy li tâm eppendorf



5417R



Eppendorf-Đức



Máy Vortex



BV1000



Greiner-Nhật



Micropipet



2-20 µl



Nichiryo-Nhật



Micropipet



20-200 µl



Nichiryo-Nhật



Micropipet



100-1000 µl



Nichiryo-Nhật



Micropipet



1-10 ml



Nichiryo-Nhật



Micropipet 8 ỗ



5-50 µl



Nichiryo-Nhật



Hệ thống bơm và thu nhận

phân đoạn



2.3

2.3.1



PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu

Hồng cầu được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt độ NKHC của



lectin là hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin.

 Chuẩn bị huyền phù hồng cầu (HC) 2%

34



Mẫu máu được rửa từ 3-5 lần. Sau đó, được định mức lên 50 ml dùng dung dịch

đệm PBS (0,02 M; NaCl 0,15M). Huyền phù HC 2% được dùng như HC tự nhiên.

Hồng cầu xử lý trypsin được chuẩn bị như sau: 1/10 thể tích của dung dịch

trypsin 0,5% (w/v) được cho vào huyền phù HC tự nhiên 2% (v/v). Hỗn hợp được ủ ở

37oC trong vòng 60 phút. Sau khi ủ, hồng cầu được rửa bằng dung dịch đệm PBS (0,02

M; NaCl 0,15M) từ 3 đến 5 lần và hòa lại bằng đệm PBS (0,02 M; NaCl 0,15M), ta thu

được dịch hồng cầu 2% đã xử lí enzyme.

 Tiến hành:



Cho 25µl PBS (0,02 M; NaCl 0,15M, pH 7,2) vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng

chữ V

Thêm 25µl mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ ngưng kết hồng cầu vào giếng

đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha là 1/2 n (n: số lần

pha lỗng).

Tiếp tục cho 25µl hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin vào tất cả các giếng.

Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 1 giờ, đọc kết quả.





Đọc kết quả:

Kết quả âm tính: tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ.

Kết quả dương tính: hồng cầu trong giếng bị ngưng kết hơn 50%.

 Đơn vị hoạt độ



1 đơn vị hoạt độ lectin hay 1 đơn vị hoạt độ NKHC viết tắt là HA (hemagglutinin

assay) trên 1 ml (HU/ml) chính là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch

lectin còn có khả năng làm ngưng kết hơn 50% lượng hồng cầu cho vào phản ứng.



35



 Hoạt độ lectin



Hoạt độ tổng (Utổng): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất định.

Đơn vị: HU

Trong đó:



Utổng = V. 2n

V: tổng thể tích (ml)

n: số lần pha lỗng



Hoạt độ riêng (Uriêng): là số đơn vị hoạt độ lectin có trong 1mg protein.

Đơn vị: HU/mg

Trong đó:



2.3.2



Utổng: tổng số đơn vị hoạt tính.

Proteintổng: tổng hàm lượng protein.

Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951)

Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự năm



1951 [5], dùng Albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất

chuẩn.

 Nguyên tắc



Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở phức chất Cu-protein khử hỗn hợp

Photphomolipden Phophovonphramat (thuốc thử Folin-ciocaltue) tạo phức chất có

màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi

nhất định. Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bước sóng 750nm.

Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein cần phân

tích.

 Hóa chất



Dung dịch A: NaOH (0,1M) + Na2CO3 (2%)

Dung dịch B: CuSO4.5H2O (0,5%) + Sodium citrate (1%)

Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 50:1 (pha trước khi sử

dụng).

Thuốc thử Folin: pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng.

Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/ml.

 Các bước tiến hành



Cân 10mg BSA hòa tan trong 10ml nước cất, ta được dung dịch gốc có nồng độ

1mg/ml. Sau đó, pha lỗng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 60,

80, 100 và 120µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.

Lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào ống

nghiệm, thêm vào đó 2,5ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó, thêm

36



vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và

để yên trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước

sóng 750nm.

Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi

quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thơng thường.

Hình 2.1: Đường chuẩn protein theo phương pháp của Lowry



Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị và tiến hành bổ sung các hóa chất như đã

nêu trên. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để

tính giá trị protein. Làm thí nghiệm với mẫu kép và lấy giá trị trung bình.



2.3.3. Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ rong biển

 Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát





Rong B.

gelatinus



Xay nhuyễn

Chiết

Lọc, ly tâm





Dịch chiết

Kết tủa

Ly tâm

Tủa



Dịch



Khảo sát:

-Dung môi chiết

-Tỉ lệ ngun liệu-dung

mơi chiết (w/v)

-Thời gian chiết (giờ)



Thẩm tích

Sắc kí trao đổi ion

DEAE-sephadex

Sắc ký lọc gel

Sepharyl S-200

37



Khảo sát:

-Nồng độ EtOH (%)



Lectin



Xác định:

-Ảnh hưởng nhiệt độ

-Ảnh hưởng của pH



Hình 2.2: Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát thu nhận lectin từ rong biển



38



 Giải thích quy trình



Mẫu rong B. gelatinus sau khi thu về được rửa sạch, xay rong thành bột mịn

bằng cối xay inox có bổ sung Nitơ lỏng, rong sau khi xay được bảo quản trong tủ đông

-20oC cho đến khi xử dụng.

Cân 2g mẫu. Tiến hành chiết lectin theo các thông số : dung môi chiết, nhiệt độ

chiết, tỉ lệ nguyên liệu:dung môi chiết, thời gian chiết thích hợp. Sau đó lọc, li tâm với

tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ bã, thu dịch chiết.

Tiếp đến, lectin trong dịch chiết được tủa bằng Ethanol ở 4 oC trong 6 giờ. Tiến

hành li tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút để thu phần tủa. Phần tủa được hòa

tan trong đệm PBS (0,02M, NaCl 0,15M, pH 7,5). Sau đó dịch tủa được thẩm tích

trong dung dịch đệm PB (0,02M, pH 7,5) ở 4oC nhằm loại bỏ muối và các phân tử nhỏ

mà không phải là lectin ra khỏi dung dịch. Dịch tủa sau thẩm tích được li tâm với tốc

độ 6000 vòng/phút trong 30 phút, thu phần dịch trong, đây là là chế phẩm lectin.

Lectin thô được tinh chế bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion DEAE-sephadex

và sắc kí lọc gel Sepharyl S-200, ta thu được dịch lectin.

2.3.4. Phương pháp xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong B.

gelatinus

Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó trong q trình tách

chiết như nồng độ dung mơi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết… thì các yếu tố còn lại



Rong B. gelatinus



được cố định. Yếu tố nào khảo sát xong thì sẽ được cố định ở giá trị thích hợp để khảo

sát đến các yếu tố khác.

Xay nhuyễn





-Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v): 1:6

-Thời gian chiết: 4 giờ

-Nhiệt độ chiết: 4oC



Chiết



Nước cất



EtOH 10%



EtOH 20%



EtOH 30%



 Khảo sát dung mơi chiết

Sơ đồ bố trí thí nghiệm





Lọc, li tâm

Dịch chiết

39



Đánh giá và chọn dung mơi thích hợp



Xác định:

-Hoạt độ tổng số

-Hoạt độ riêng



PBS



Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát dung mơi chiết



Giải thích quy trình

Cân 2g mẫu, tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinus bằng 5 dung môi: nước

cất, đệm PBS 0,05M 0,85% NaCl, ethanol 10%, ethanol 20%, ethanol 30% với tỷ lệ

nguyên liệu:dung môi (w/v) 1:6, nhiệt độ chiết 4oC và thời gian chiết 4 giờ. Sau đó, ly

tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết.

Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng dịch chiết. So sánh, chọn

ra loại dung mơi chiết thích hợp.



Rong B. gelatinus

 Khảo sát tỷ lệ dung mơi chiết

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Xay nhuyễn



-Dung môi chiết

-Thời gian chiết: 4 giờ

-Nhiệt độ chiết: 4oC







Chiết



1:4 (w/v)







1:6 (w/v)



1:8 (w/v)



1:10 (w/v)



Lọc, li tâm

Dịch chiết

40



Xác định:

-Hoạt độ tổng số

-Hoạt độ riêng



Đánh giá và chọn tỉ lệ nguyên liệu:dung mơi (w/v) thích hợp



Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi chiết (w/v)



Giải thích quy trình

Cân 2g mẫu, tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinus bằng dung mơi thích

hợp đã khảo sát với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, ở nhiệt độ

4oC và thời gian chiết là 4 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15

phút, thu dịch chiết.

Xác định hàm lượng protein, hoạt độ tổng số (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR)

của từng DC. So sánh, chọn ra tỷ lệ ngun liệu : dung mơi chiết (w/v) thích hợp.



 Khảo sát thời gian chiếtRong B. gelatinus

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Xay nhuyễn



-Dung mơi chiết

-Tỉ lệ ngun liệu: dung mơi (w/v)

-Nhiệt độ chiết: 4oC







Chiết



2 (giờ)



4 (giờ)







6 (giờ)



8 (giờ)



Lọc, li tâm

Dịch chiết

41



Xác định:

-Hoạt độ tổng số

-Hoạt độ riêng



Đánh giá và chọn thời gian chiết (giờ) thích hợp



Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ thời gian chiết (giờ)



Giải thích quy trình

Cân 2g mẫu, tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinus với các khoảng thời gian

khác nhau: 2, 4, 6, 8 (giờ), với dung môi, tỷ lệ nguyên liệu : dung mơi (w/v) thích hợp

và nhiệt độ chiết 4oC. Sau đó, ly

tâm với

độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC.

Rong

B. tốc

gelatinus

Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng DC. So sánh, chọn ra

thời gian chiết thích hợp.

Xay nhuyễn



2.3.5



-Dung môi chiết: EtOH 20%

-Tỉ (%)

lệ nguyên

môichế

chiết

(w/v): 1:6

Khảo sát các tác nhân tủa Ethanol Chiết

và nồng độ

thíchliệu-dung

hợp để thu

phẩm

-Thời gian chiết (giờ): 4

lectin kỹ thuật

-Nhiệt độ chiết: 4oC

Lọc,

ly

tâm

Sơ đồ bốBãtrí thí nghiệm

Dịch chiết

-Tác nhân EtOH (%)

-Thời gian tủa: 4 giờ

-Nhiệt độ tủa: 4oC



Kết tủa



60%



70%



80%



Ly tâm

Tủa

Thẩm tích

Lectin42thơ



Xác định:

-Hoạt độ tổng số

-Hoạt độ riêng



Đánh giá và chọn nồng độ Ethanol thích hợp







Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ EtOH (%)



Giải thích quy trình

Sau khi xác định các điều kiện thích hợp để chiết lectin từ rong đỏ B.

gelatinus. Tiến hành khảo sát khả năng kết tủa lectin trong dịch chiết bằng các nồng độ

Ethanol khác nhau: 60, 70, 80%. Thời gian tủa 6 giờ và nhiệt độ tủa là 4oC

Chế phẩm lectin được thu nhận bằng cách li tâm dịch tủa với tốc độ 6000

vòng/phút trong 30 phút. Sau đó, phần tủa được hòa tan trong đệm PBS (0,02M, NaCl

0,15M, pH 7,5) trước khi thẩm tích bằng dung dịch đệm PB (0,02M, pH 7,5) ở 4 oC.

Dịch tủa sau thẩm tích được li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút, thu phần

dịch trong. Đây chính là chế phẩm lectin.

Tiến hành xác định HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của chế phẩm lectin, từ

đó chọn ra nồng độ tủa EtOH (%) thích hợp.

2.3.6



Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose.

Nhựa DEAE sepharose là nhựa trao đổi anion yếu. Hỗn hợp mẫu qua cột sắc kí



chứa nhiều loại protein với khả năng tích điện tích âm khác nhau, do đó khả năng liên

kết với nhựa cũng sẽ khác nhau. Trong quá trình rửa giải, khi thay đổi nồng độ muối,

43



những protein nào liên kết yếu với cột sẽ bị đẩy ra trước, còn những protein liên kết

chặt hơn sẽ bị đẩy ra ở nồng độ muối cao hơn

Dịch lectin thô được tinh chế bằng sắc kí trao đổi ion DEAE-sepharose với các

thơng số được thiết lập như sau:

- Gel: DEAE-Sepharose

- Kích thước cột: 1,6 x 20 cm

- Đệm: PB (0,02M; pH 7,5) (de gas) ; PBS (0,02M; NaCl 0,2M; pH 7,5) (de gas)



Thể tích mẫu: 6ml



-



- Tốc độ dòng: 10 ml/phút

- Thể tích mỗi phân đoạn: 10 ml/phân đoạn

- Số lượng phân đoạn: 36 phân đoạn

- Tổng thể tích rửa giải: 360 ml



Xác định hoạt tính NKHC của các phân đoạn, từ đó thu nhận các phân đoạn có

hoạt tính và tiến hành cơ đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa

Vẽ đồ thị biễu diễn sự tương quan giá trị A 280 nm, hoạt độ NKHC và thứ tự các

phân đoạn.

2.3.7. Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S-200

Hệ thống sắc kí lọc gel gồm pha cố định là một loại gel có cấu tạo dạng mạng

lưới (rây) và lỗ rây. Kích thước của các lỗ rây này là khác nhau tùy theo loại gel sử

dụng. Còn pha động là đệm hay một loại dung mơi thích hợp. Các chất khi đi qua hệ

thống lọc gel sẽ được phân tách theo nguyên tắc: các phân tử có kích thước to hơn kích

thước lỗ rây, không thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng sẽ len qua phần kẽ hở giữa các

hạt gel và nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột. Còn các phân tử

có kích thước phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ rây sẽ tồn phần hoặc bán tồn phần lọt

vào lỗ rỗng, cuối cùng theo dòng chảy ra khỏi cột.

Sephacryl S-200 có khả năng phân tách những protein có kích thước 5x10 32,5x105 Da.

Dịch lectin sau khi khi tinh sạch bằng sắc kí trao đổi ion được thẩm tích trong

đệm PB (0,02M pH 7,5) và tiến hành tinh sạch bằng kĩ thuật sắc khí lọc gel với các

thơng số được thiết lập như sau:

-



Gel: Sephacryl S-200

Kích thước cột: 1,6 x 60 cm.

44



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×