Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

STT



Hóa chất, dung mơi



Xuất xứ



9



H3PO4 (Merk)



Đức



Chất chuẩn loganin. Độ tinh khiết

10



98%, hãng sản xuất: weikeqi –

biotech. Số lô: wkq17112205



Công ty CP

Dược phẩm

VCP cung

cấp



- Các trang thiết bị được trình bày ở Bảng 2.2

Bảng 2.2. Trang thiết bị sử dụng trong phân tích

STT



Tên thiết bị



Xuất xứ



1



Bếp đun cách thủy Bath HH- S4



Trung Quốc



2



Bếp hồng ngoại Sanaky AT-2521HGN



Trung Quốc



3



Tủ sấy Memmerk, Shellab



Đức



4



Cân phân tích Sartorius – TE214S



Đức



5



Cân kỹ thuật Precisa – XB320C



Thụy Sĩ



6



Máy ly tâm Universal PLC-012E



Đức



7



Đèn tử ngoại Viber Lourmat



Pháp



Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng

8



hiệu năng cao Linomat 5 (Camag



Thụy Sĩ



Switzeland)

9



Kính hiển vi quang học Labomed



Mỹ



Hình 2.2. Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Linomat 5 (Camag Switzeland)

Và các dụng cụ, thiết bị khác.



13



2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Điều chế cao đặc



Điều chế cao đặc Kỷ cúc địa hoàng bằng phương pháp sắc với nước.

2.2.2. Định tính bằng phản ứng hóa học



Định tính một số nhóm chất chính: tinh bột, flavonoid, saponin, coumarin,

polysaccharid… trong cao đặc và dược liệu bằng phản ứng hóa học với các thuốc

thử chung và thuốc thử đặc hiệu của từng nhóm [4].

2.2.3. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng

- Mẫu nghiên cứu: Dược liệu Thục địa, Trạch tả, Cúc hoa, Đơn bì, Bạch phục linh,

Sơn thù, Hồi sơn, Câu kỷ tử, Cao đặc bài thuốc.

- Chiế t xuất: Cao đặc bài thuốc, các dược liệu (đã xay thô) bằ ng dung mơi thích hợp .

- Tiến hành sắc kí để xác định các vết và Rf của từng nhóm chất.

- So sánh với chất chuẩn và các dược liệu chuẩn.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Điều chế cao đặc

- Công thức phương thuốc:

Thục địa

24g

Bạch phục linh

9g

Sơn thù

12g

Trạch tả

9g

Hồi sơn

12g

Cúc hoa

9g

Đơn bì

9g

Câu kỷ tử

9g

- Cao được bào chế từ các dược liệu: Thục địa, Hồi sơn, Sơn thù, Đơn bì, Bạch linh,

Trạch tả, Câu kỷ tử, Cúc hoa

Cân khối lượng dược liệu gấp 2 lần bài thuốc gốc, thêm lượng nước gấp 8 lần tổng

dược liệu bài thuốc, đun sôi trong 90 phút. Gạn lấy dịch chiết, lọc. Làm 3 lần. Gộp tất

cả dịch chiết được dịch chiết tổng. Để lắng 24 giờ, chia hai phần dịch lỗng cơ trước,

dịch đặc cơ sau. Cô đến thể chất cao đặc, hàm ẩm dưới 20%.

- Phương pháp: chiết nóng với dung mơi nước theo sơ đồ Hình 2.2



14



Dược liệu

Sắc với

nước

Bã dược

liệu



Dịch chiết

nước

Để lắng 24h, dịch lỗng cơ

trước, dịch đặc cơ sau. Hàm

ẩ m dưới 20 %

Cao đặc

Hình 2.3. Sơ đồ điều chế cao đặc Kỷ cúc địa hồng



- Tỷ lệ cao chiết được tính theo công thức:

H (%) =



Khối lượng cao khô kiệt

Khối lượng dược liệu khơ kiệt



× 100



- Quan sát, mơ tả tính chất cao đặc về cảm quan

+ Thể chất, độ đồng nhất: Cho cao lên lam kính, đặt la men lên trên ép sát đem

soi dưới kính hiển vi, kiểm tra độ đồng nhất.

+ Màu sắc: Lấy 1 g cao cho lên một tờ giấy trắng hoặc mặt kính đồng hồ khơng

màu, đặt lên tờ giấy trắng, quan sát.

+ Mùi: Trên một mặt kính đồng hồ, đường kính từ 6 -8 cm, lấy 0,5 – 2,0 g cao

trải thành lớp mỏng, sau 15 phút, xác định mùi.

+ Vị: Xác định bằng cảm quan.

- Xác định hàm ẩm cao đặc: Tiến hành theo Phụ lục 9.6 (PL – 203) DĐVN V [4].

Lấy khoảng 1g cao đặc sấy ở nhiệt độ 1000C đến khối lượng không đổi (chênh lệch

giữa 2 lần cân không quá 0,5 mg), làm 3 lần với mỗi mẫu rồi tính kết quả trung bình.

2.3.2. Định tính một số nhóm chất chính trong cao đặc Kỷ cúc địa hồng và dược

liệu bằng phản ứng hóa học

- Mẫu nghiên cứu: Dược liệu Thục địa, Trạch tả, Cúc hoa, Đơn bì, Bạch phục linh,

Sơn thù, Hoài sơn, Câu kỷ tử, Cao đặc bài thuốc.

- Tiến hành: đinh

̣ tính các nhóm chấ t hữu cơ bằ ng thuố c thử chung và thuốc thử đặc

hiệu của từng nhóm chấ t (alcaloid, flavonoid, saponin, tanin, coumarin.....)



15



 Định tính Flavonoid:

-



Mẫu nghiên cứu:



 Cao đặc: Cân 2g cao đặc cho vào các bình nón, pha lỗng bằng 50ml nước cất.

Đun trên bếp cách thủy cho tan hết, để lắng, lọc. Dịch lọc đem lắc với n-hexan

để loại tạp, lắc 3 lần, mỗi lần 15ml n-hexan. Dịch chiết nước thu được lắc với

EtOAc 3 lần, mỗi lần 15ml. Gộp các dịch chiết EtOAc lại, bốc hơi dung môi,

cắn thu được hòa tan trong 10ml ethanol 90% làm phản ứng định tính.

 Dược liệu: Cân 2g dược liệu mỗi loại cho vào các bình nón, thêm 50ml EtOH

90%. Đun cách thủy sơi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc được tiến hành các

phản ứng định tính.

-



Tiến hành:



 Phản ứng Cyanidin:

 Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại (khoảng

20mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt), để yên một vài phút.

 Phản ứng dương tính: dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu nâu đỏ.

 Phản ứng với kiềm:

 Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%.

 Phản ứng dương tính: thấy xuất hiện tủa vàng, thêm 1ml nước cất, tủa tan và

màu vàng của dung dịch được tăng thêm.

 Phản ứng với hơi amoniac:

 Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ ammoniac

đặc đã được mở nút.

 Phản ứng dương tính: thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên.

 Phản ứng với FeCl3:

 Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.

 Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa xanh đen.

 Phản ứng diazo hóa:

 Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm

(NaOH), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều (hoặc đun nóng trên

nồi cách thủy trong vài phút).

 Phản ứng dương tính: dung dịch xuất hiện màu đỏ.

 Định tính Saponin:



16



-



Mẫu nghiên cứu:



 Cao đặc: Cân 2g cao đặc cho vào các bình nón, pha lỗng bằng 20ml nước cất.

Đun trên bếp cách thủy cho tan hết, để lắng, lọc. Dịch lọc đem lắc với n-hexan

để loại tạp, lắc 3 lần, mỗi lần 10ml n-hexan. Dịch chiết nước thu được lắc với nbuthanol 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp các dịch chiết n-buthanol lại, bốc hơi dung

mơi, cắn thu được hòa tan trong 10ml ethanol 90% làm phản ứng định tính.

 Dược liệu: Cân 2g dược liệu mỗi loại cho vào các bình nón, thêm 50ml EtOH

90%. Đun cách thủy sơi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc được tiến hành các

phản ứng định tính.

-



Tiến hành:



 Hiện tượng tạo bọt:

 Cho một ít MNC vào ống nghiệm lớn, thêm khoảng 10ml nước cất, lắc

mạnh theo chiều dọc trong ống nghiệm khoảng 5 phút. Để yên và quan sát

hiện tượng tạo bọt.

 Phản ứng dương tính khi cột bọt bền vững sau 15 phút.

 Phản ứng Salkowski:

 Lấy 1ml DC vào ống nghiệm, bốc hơi đến cắn, hòa tan cắn trong 1ml

cloroform. Nghiêng ống nghiệm 45°, nhỏ từ từ đồng lượng dung dịch acid

sulfuric đặc theo thành ống.

 Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng màu đỏ tím giữa hai lớp.

 Định tính tanin:

-



Mẫu nghiên cứu:



Cân 2g cao đặc, dược liệu mỗi loại cho vào các bình nón, thêm 30ml nước cất. Đun

sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch chiết thu được làm các phản ứng định tính.

-



Tiến hành:

 Ống 1:

o Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%.

o Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc

xanh nâu nhạt.

 Ống 2:

o Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10%.

o Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bơng.



17



 Ống 3:

o Lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%.

o Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bơng trắng.

 Định tính alkaloid:

-



Mẫu nghiên cứu:



Cân 2g cao đặc, dược liệu mỗi loại cho lần lượt vào bình nón dung tích 50 ml có nút

mài. Thêm 25 ml dung dịch H2SO4 1N, đun đến sôi, để nguội, lọc lấy dịch lọc. Cho

dịch lọc vào bình gạn 100ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac đặc đến pH

= 9 - 10 (thử bằng chỉ thị màu vạn năng). Chiết alkaloid base bằng CHCl3 (3 lần x 10

mL), gạn lấy lớp CHCl3, bốc hơi đến cách thủy tới khô, thu được cắn. Hòa tan cắn

bằng 3ml H2SO4 1N. Chia dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ.

-



Tiến hành:

 Ống 1:

o Nhỏ 2 - 3 giọt tt Mayer.

o Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng đến vàng.

 Ống 2:

o Nhỏ 2 - 3 giọt tt Dragendorff.

o Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng cam đến đỏ.

 Ống 3:

o Nhỏ 2- 3 giọt tt Bouchardat.

o Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu đến đỏ nâu.



 Định tính polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, đường khử:

-



Mẫu nghiên cứu:



Cân 2g cao đặc, dược liệu mỗi loại, cho vào từng bình nón riêng biệt, thêm 30ml

nước cất. Đun sơi trong 10 phút. Để nguội, lọc. Dịch chiết thu được làm các phản ứng

định tính.

-



Tiến hành:



 Định tính polysaccharid:

 Đun cách thủy 2ml dịch lọc với 0,5ml dung dịch Lugol (tt) trong vài phút.

 Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển sang màu tím đỏ - xanh tím.

 Định tính acid hữu cơ:

 Cho 2ml dịch lọc vào 2 ống nghiệm, thêm vào ít bột Na2CO3.



18



 Phản ứng dương tính khi thấy có bọt khí bay lên.

 Định tính acid amin:

 Đun cách thủy 2ml dịch lọc với 3 giọt tt Ninhydrin trong 2 - 3 phút.

 Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu tím.

 Định tính đường khử:

 Đun cách thủy 2ml dịch lọc với 0,5ml tt Fehling A và 0,5ml Fehling B trong

vài phút.

 Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa đỏ gạch.



Định tính Sterol:

-



Mẫu nghiên cứu:



Cân 2g cao đặc, dược liệu mỗi loại, cho vào từng bình nón riêng biệt, thêm 50ml

ether dầu hoả. Đun sơi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch chiết thu được làm các phản

ứng định tính.

-



Tiến hành:

 Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch chiết ether dầu hỏa của dược

liệu, cô cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydride

acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ



H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.

 Phản ứng dương tính nếu mặc phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía

trên có màu xanh lá.

2.3.2. Định tính so sánh mẫu cao đặc Kỷ cúc địa hoàng và các vị thuốc bằng SKLM:

 Mẫu nghiên cứu:

- Cao đặc bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng

- Mẫu dược liệu chuẩn: Thục địa chuẩn, Bạch phục linh chuẩn, Đơn bì

chuẩn, Câu kỷ tử chuẩn, Cúc hoa chuẩn, Trạch tả chuẩn, Hoài sơn, Sơn thù.

- Chất chuẩn: loganin.

 Chiết mẫu

- Mẫu cắn methanol cao đặc: Cân 2g cao đặc vào bình nón, thêm 20 ml MeOH,

lắc siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc được thấm MeOH. Cô dịch lọc cách thủy đến

cắn. Hòa cắn trong 2 ml MeOH, lọc qua giấy lọc làm dung dịch chấm sắc ký.

- Mẫu cắn ethylacetat cao đặc: Cân 2g cao đặc vào bình nón, thêm 10 ml ethanol

96 %, đun sơi hồi lưu 30 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc tới cắn, hòa tan cắn trong 20 ml

nước nóng, lọc rồi lắc 2 lần với ethyl acetat mỗi lần 10ml, gộp dịch chiết, cơ tới cắn,

19



hòa cắn trong 1 ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký.

- Mẫu cắn cloroform cao đặc: Cân 2g cao đặc vào bình nón, thêm 10 ml hỗn hợp

CHCl3 – methanol (4:1), đun sôi dưới sinh hàn hồi lưu khoảng 10 phút. Để nguội, lọc,

cô dịch lọc còn 1ml được dung dịch chấm sắc ký.

- Mẫu dược liệu chuẩn: Thục địa chuẩn, Bạch phục linh chuẩn, Đơn bì chuẩn, Câu kỷ

tử chuẩn, Cúc hoa chuẩn, Trạch tả chuẩn. Cân 1 g mỗi dược liệu chuẩn, tiến hành chiết

như mẫu cắn methanol cao đặc được dịch chấm sắc ký của từng dược liệu chuẩn.

- Mẫu Sơn thù chuẩn: Cân 1 g Sơn thù chuẩn, tiến hành chiết như mẫu cắn ethyl acetat

cao đặc được dịch chấm sắc ký.

- Mẫu Hoài sơn chuẩn: Cân 1g Hoài sơn chuẩn, tiến hành chiết như mẫu cắn cloroform

cao đặc được dịch chấm sắc ký

- Chất chuẩn loganin: Hòa tan 10mg loganin chuẩn trong 10ml methanol được dung

dịch có nồng độ 1 mg/ml.

 Điều kiện sắc kí chung

- Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254, hoạt hóa ở 110oC trong 60 phút

- Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi khác nhau tùy từng dược liệu mỗi loại.

- Phun mẫu: Thiết bị Linomat 5 (Camag), tốc độ phun 150nl/s.

- Triển khai:

+ Dùng máy triển khai sắc ký tự động ADC2.

+ Kiểm sốt độ ẩm: dung dịch KSCN bão hòa trong 10 phút.

+ Bão hòa bình triển khai 20 x 10 trong 20 phút (giấy lọc) bằng 25ml dung

môi pha động.

+ Thể tích dung mơi khai triển: 10 ml.

+ Khoảng cách triển khai là 85 mm kể từ đáy bản mỏng. Sấy khô bản

mỏng trong 5 phút.

Phát hiện: Soi UV ở bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc thuốc thử hiện màu đặc

trưng tùy loại dược liệu.

Chụp ảnh sắc ký đồ: Buồng chụp Camag.

Xử lý kết quả: Phần mềm Wincats, Videoscan.



Tiến hành: Chấm các mẫu trên băng dài 6 mm, cách cạnh dưới bản mỏng

10 mm, cách cạnh bên 15 mm. Triển khai theo điều kiện chung.



20



CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1.Điều chế cao đặc



- Điều chế cao đặc theo sơ đồ hình 2.2

- Làm 3 mẻ, tính hàm ẩm, tỷ lệ cao chiết được

- Kết quả về thể chất cao đặc, hàm ẩm, tỷ lệ cao chiết được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1. Hàm ẩm, tỷ lệ cao chiết, thể chất cao đặc Kỷ cúc địa hoàng

Mẻ



Hàm ẩm (%)



tỷ lệ cao chiết (%)



Thể chất cao đặc



43,32



- Thể chất: đặc, sánh, hơi dính tay



2



17,85

15,75



43,42



- Màu sắc: màu đen tuyền



3



17,75



43,67



- Mùi vị: mùi thơm, vị hơi chua



1



Nhận xét: Các chỉ tiêu về thể chất cao đặc, hàm ẩm dược liệu của cao đặc đạt tiêu

chuẩn DĐVN V. Tỷ lệ cao chiết được dao động từ 43,32% đến 43,67%

3.2.Định tính các nhóm chất chính trong cao Kỷ cúc địa hồng và dược liệu bằng

phản ứng hóa học

Tiến hành định tính các nhóm chất chính trong mẫu cao đặc và dược liệu bằng các

phản ứng hóa học thường quy. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.2:

Bảng 3.2. Kết quả định tính một số nhóm chất trong mẫu cao đặc và các vị thuốc

TT



Nhóm

chất



1



Flavonoid



2



3



4



5



Saponin



Tanin



Alkaloid



Polysacch



Phản ứng

định tính

Cyanidin

Kiềm

NH3

FeCl3

Diazo hố

Tạo bọt





-





Salkowski

FeCl3

Chì Acetat

Gelatin

Tt Mayer

Tt

Bouchardat

Tt

Dragendorff

Tt Lugol



Kết quả

ĐB BL

TT

++

++

+

++

++

-



-



ST

++

++

+

++

++



HS

++



CH

+

++

+

+

+



CKT

-



-



-



Cao

+

++

+

+

+

++



-



+



+



+



-



-



-



-



+



-



++

++

++

-



-



++



-



-



-



++



++

++

++

++



-



-



-



++



-



-



-



++



++



-



-



-



+



-



-



-



+



+



-



++



-



-



++



++



++



-



++



21



Nhóm

chất

-aride



TT



6

7

8



Acid amin

Acid hữu



Đường

khử



9



Sterol



Phản ứng

định tính



Kết quả

ĐB BL

TT







ST



HS



Tt

Ninhydrin



-



+



+



-



-



Tt Na2CO3



-



++



-



+



+



-



+



-



++



+



Tt Fehling

A và B



LiebermannBurchardat



CH



CKT



Cao



-



+



+



+



-



-



++



++



++



-



+



-



-



-



+



++



-



+



-



++



++



Ghi chú (-): âm tính; (+):dương tính;(++): dương tính rõ

Nhận xét

- Trong cao bài thuốc có chứa các nhóm chất: saponin, flavonoid, tanin, alkaloid, acid

hữu cơ, đường khử, acid amin, polysaccharide, sterol. Trong đó các phản ứng định tính

nhóm flavonoid, acid hữu cơ, sterol cho kết quả rõ nhất.

- Trong Thục địa có: glycosid tim, đường khử.

- Trong Sơn thù có: flavonoid, saponin, glycosid tim, tanin, polysaccharide, acid amin,

acid hữu cơ, sterol.

- Trong Hồi sơn có: saponin, acid amin, đường khử, sterol.

- Trong Đơn bì có: saponin, glycosid tim, alkaloid, acid hữu cơ, sterol.

- Trong Bạch linh có: polysaccharide, đường khử.

- Trong Trạch tả có: flavonoid, polysaccharide, sterol.

- Trong Cúc hoa có: flavonoid, polysaccharide, acid amin, acid hữu cơ.

- Trong Câu kỷ tử có: alkaloid, acid amin, acid hữu cơ, sterol.

Bàn luận

Từ TPHH của các dược liệu, tiến hành định tính các nhóm chất bằng phản ứng

hóa học kết quả mục 3.2 cho thấy cao đặc Kỷ cúc địa hồng có các nhóm chất

flavonoid, alkaloid, saponin, coumarin, tanin, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ,

đường khử. Tương ứng với TPHH chính trong các vị dược liệu có trong phương thuốc.

Trong đó các phản ứng định tính nhóm flavonoid, acid hữu cơ, sterol cho kết quả rõ

nhất.

Từ kết quả các phản ứng định tính trên chúng tơi đưa ra tiêu chuẩn định tính

cao bài thuốc Kỷ cúc địa hồng như sau:

- Định tính sự có mặt của nhóm acid hữu cơ.



22



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×