Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Sơ đồ 1: Quy trình phân lập vi khuẩn S. suis (Viện Thú y Quốc gia)

Sơ đồ 1: Quy trình phân lập vi khuẩn S. suis (Viện Thú y Quốc gia)

Tải bản đầy đủ - 0trang

- Nguyên tắc: Phương pháp PCR để xác định gen mã hóa một số yếu tố độc lực và

các serotype gây bệnh thông thường (1, 2, 7, 9) của vi khuẩn S. suis được thực hiện

theo (Wisselink H.J. và cs. (2002b) [131]; Silva L.M. và cs. (2006) [114] và Đỗ

Ngọc Thúy và Lê Thị Minh Hằng (2009a) [31].

- Phản ứng PCR để xác định các serotype 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn S. suis

Bốn serotype S. suis gây bệnh thường gặp nhất ở lợn được xác định bằng

phản ứng PCR.

- Mồi của phản ứng: Các cặp mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7 và 9

của S. suis được lựa chọn dựa vào chuỗi gen mã hố q trình sinh tổng hợp thành

phần polysaccharide của giáp mô (cps), gồm 4 cặp mồi: cps 1J - F và cps 1J - R để

xác định serotype 1, cps 2J - F và cps 2J - R để xác định serotype 2, cps 7H - F và

cps 7H- R để xác định serotype 7, cps 9H - F và cps 9H - R để xác định serotype 9.

Trình tự các mồi và các sản phẩm tương ứng của chúng tạo ra được trình bày ở

bảng:

Trình tự các mồi trong phản ứng PCR dùng để xác định các serotype

của vi khuẩn S. suis

Gen



Ký hiệu



đích



primers



Kích cỡ

Chuỗi primers (5’- 3’)



sản

phẩm

(bp)



cps 1

cps 2

cps 7

cps 9



cps1J - F



5' - TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T - 3'



cps1J - R



5' - TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A- 3'



cps2J - F



5' - TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG - 3'



cps2J - R



5' - TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC - 3'



cps7H - F



5' - AAT GCC CTC GTG GAA TAC AG - 3'



cps7H - R



5' - TCC TGA CAC CAG GAC ACG TA - 3'



cps9H - F



5' - GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT- 3'



637 bp

498 bp

379 bp



303 bp

cps9H - R

5' - CCG AAG TAT CTG GGC TAC TGA- 3'

- Phản ứng PCR xác định các gen mã hoá một số yếu tố độc lực của vi khuẩn S. suis



- Việc xác định 4 yếu tố gây bệnh của S. suis được thực hiện bằng phản ứng

PCR phức hợp (Multiplex PCR), tức là có sự phối hợp của nhiều loại mồi khác

nhau trong cùng một phản ứng.

- Mồi của phản ứng được thiết kế dựa vào chuỗi gen mã hoá sinh tổng hợp

4 yếu tố liên quan đến độc lực là: yếu tố ngoại bào (EF, epf), protein giải phóng

muramidase (MRP, mrp), suilysin (SLY, sly) và enzym arginine deiminase (ARC,

arcA). Trình tự các mồi và các sản phẩm tương ứng của chúng tạo ra được trình bày

ở bảng sau:

Trình tự các mồi trong phản ứng PCR dùng để xác định một số

gen mã hoá các yếu tố độc lực

Gen



Ký hiệu



đích



primers



epf

sly

mrp

arc



Chuỗi primers (5’ - 3’)



epf - F



5' - CGC AGA CAA CGA AAG ATT GA - 3'



epf - R



5' - AAG AAT GTC TTT GGC GAT GG - 3'



sly - F



5' - GCT TGA CTT ACG AGC CAC AA - 3'



sly - R



5' - CCG CGC AAT ACT GAT AAG C - 3'



mrp - F



5' - ATT GCT CCA CAA GAG GAT GG - 3'



mrp - R



5' - TGA GCT TTA CCT GAA GCG GT - 3’



arcA - F



5' - TGA TAT GGT TGC TGC TGG TC - 3'



arcA - R



5' - GGA CTC GAG GAT AGC ATT GG - 3'



Kích cỡ sản

phẩm (bp)

744 bp

248 bp

188 bp

118 bp



Các thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng dùng để xác định serotype của

S. suis giống như trong phản ứng dùng để xác định các gen mã hoá các yếu tố độc

lực được trình bày chi tiết trong bảng sau:



Thành phần các chất trong phản ứng MP - PCR dùng để xác định một số các

serotype gây bệnh thông thường và các gen mã hoá các yếu tố độc lực

Thành phần



Thể tích (µl)



Nồng độ



Mồi xi



1+1+1+1



3,2 µM/ µl



Mồi ngược



1+1+1+1



3,2 µM/ µl



5



-



0.05



500 UI



Nước khử ion



12



-



Tổng cộng



25



-



Dung dich đệm AMP x 5 gồm:

- 750 mM Tris - HCl (pH=8)

- 200mM (NH4)2SO4

- 0,1% (v/v) Tween 20

- dNTPs

- 2mM MgCl2

Taq - polymerase



- Các chu kỳ nhiệt của phản ứng:

Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định một số các serotype gây

bệnh thông thường và các gen mã hoá các yếu tố độc lực

Nhiệt độ

(0C)



Thời gian

(phút)



kỳ nhiệt



Giai đoạn tiền biến tính



94



5



1



Giai đoạn biến tính



94



1



Giai đoạn bắt cặp



53



1



Giai đoạn tổng hợp



72



1,5



Giai đoạn kéo dài



72



7



Các giai đoạn của phản ứng



Số chu



35

1



- Phân tích sản phẩm: Các sản phẩm của phản ứng PCR được tiến hành chạy điện

di trên thạch agarose 2% trong dung dịch 1 x TAE với hiệu điện thế 50V trong 30

phút, đọc kết quả và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc 2000.



PHỤ LỤC 5

Phản ứng ngưng kết trên phiến kính để xác định serotype gây bệnh thông

thường của vi khuẩn S. suis

Phản ứng ngưng kết trên phiến kính là phản ứng hyết thanh học thường được

áp dụng cho việc đánh giá theo đàn, được kiểm tra là có hay khơng kháng thể của

bệnh nào đó.

1. Nguyên lý phản ứng

Kháng thể có trong huyết thanh kết hợp với kháng nguyên của vi khuẩn đã

biết (S. suis) để tạo thành phức hợp kháng nguyên kháng thể mà ta có thể quan sát

thấy (kháng nguyên chuẩn thường được gắn màu nên phức hợp này là những hạt

chấm có màu đỏ trong dung dịch trong suốt).

2. Tiến hành phản ứng

- Nguyên liệu phản ứng và mẫu huyết thanh để ở nhiệt độ phòng (khoảng 25 0C)

khoảng 1 giờ trước khi làm phản ứng.

- Lắc đều lọ kháng nguyên một cách nhẹ nhàng để kháng nguyên chắc chắn được

đồng nhất.

- Nhỏ 30 µl mẫu huyết thanh lên trên phiến kính.

- Nhỏ 30 µl kháng ngun lên huyết thanh.

- Trộn đều mẫu huyết thanh với kháng nguyên bằng que trộn.

- Lặp lại các bước trên với huyết thanh đối chứng âm, dương.

- Nhẹ nhàng lắc tròn phiến kính trong 2 phút (có thể sử dụng máy lắc).

- Quan sát sự ngưng kết sau 2 phút kể từ lúc bắt đầu lắc, đây là khoảng thời gian tốt

nhất để đánh giá kết quả.

3. Đánh giá kết quả

Phản ứng âm tính: Khơng có ngưng kết.

Phản ứng dương tính (có kháng thể đặc hiệu): Có các hạt ngưng kết lấm tấm.



PHỤ LỤC 6

Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh

của các chủng vi khuẩn S. suis

Cách tiến hành: vi khuẩn S. suis nuôi cấy trong môi trường thạch TSA qua

đêm. Các khuẩn lạc của vi khuẩn được tạo huyền phù trong nước muối sinh lý 0,9%

để được độ đục tương đương ống McFarland 1 (3 x 10 8 CFU/ml). Dùng tăm bông vô

trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên thạch đĩa Muller Hinton, rồi đặt

các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt đĩa thạch. Nuôi vi khuẩn ở 37 oC/18 - 24

giờ (5% CO2). Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với

bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn

kiểm tra ở bảng sau.

Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với

một số loại kháng sinh (NCCLS - 2002)

TT



Loại

sinh



kháng



1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12



Ceftiofur

Ampicillin

Amoxicillin

Neomycin

Ofloxacin

Gentamicin

Lincomycin

Colistin

Tetracyclin

Erythromycin

Florphenicol

Penicillin G



Đường kính vòng vơ khuẩn (mm)

Hàm lượng Mẫn cảm Mẫn cảm Kháng

cao

trung bình thuốc

≤ 17

30 µg

≥ 21

18 - 20

10 µg

≥ 22

19 - 21

≤ 18

20 µg

≥ 20

≤ 19

30 µg

≥ 17

13 - 16

≤ 12

5 µg

≥ 15

13 - 14

≤ 12

10 µg

≥ 19

≤ 15

15 µg

≥ 15

13 - 14

≤ 12

10 µg

≥ 15

13 - 14

≤ 12

30 µg

≥ 29

26 - 28

≤ 25

15 µg

≥ 21

16 - 20

≤ 15

30 µg

≥ 23

≤ 20

10 µg

≥ 22

19 - 21

≤ 18



PHỤ LỤC 7



Giống vi khuẩn S. suis



Thạch Columbia

Tủ ấm CO2/37oC/24h

Chọn khuẩn lạc điển hình

10 ml nước thịt BHI

Lắc 300 - 500 lần/phút



Tủ ấm 37oC/24h



Đạt tiêu chuẩn thuần khiết

Lắc 300 - 500 lần/phút



Tủ ấm 37oC/24h



Sản xuất giống cấp II (100 ml BHI), sau đó giống cấp III (1000 ml BHI)

Đếm số lượng vi khuẩn



Đạt tiêu chuẩn thuần khiết



Bổ sung fomalin tỷ lệ 0,3%

Lắc 300 - 500 lần/phút



Tủ ấm 37oC/24h



Đạt chỉ tiêu vô trùng

Trộn lẫn 3 loại canh trùng theo tỷ lệ 1:1:1

Bổ sung keo phèn tỷ lệ 1/5 (20%)

Đạt chỉ tiêu vơ trùng

Ra chai

Kiểm tra

An tồn



Vơ trùng



Hiệu lực



Sơ đồ 2: Tóm tắt quy trình chế tạo vaccine (Viện Thú y quốc gia)

(Theo quy trình sản xuất vaccine vơ hoạt bổ trợ keo phèn ni cấy tĩnh)



PHỤ LỤC 8

PHƯƠNG PHÁP TÍNH LIỀU LD50 THEO REED-MUENCH (1938)

TRÊN CHUỘT BẠCH

Liều gây chết 50% (LD50) của các serotype 2, 7 và 9 được tính theo cơng thức sau:



LgLD50 = LgA +



a − 50

×d

a −b



Trong đó:

A là nồng độ pha loãng gây chết sát trên 50% chuột. a là tỷ lệ chuột chết do

liều A gây ra (%). b là tỷ lệ chuột chết do liều B gây ra (%) (cộng dồn), d là lg của

nồng độ pha loãng.

1. Liều LD50 của vi khuẩn S. suis serotype 2

Bảng 1: LD50 của vi khuẩn S. suis serotype 2

Các giá trị tích lũy

Độ pha

Số

Số

Số

Chuột

lỗng

Số

Số

chuột

chuột

chuộ

thí

canh

chuột chuộ

chết

sống

t

nghiệ

khuẩn

tiêm t chết

cộng

cộng

sống

m

(CFU/ml (con) (con)

dồn

dồn

(con)

(con)

)

(con)

(con)

(A)

(B)

(A+B)

-1

10

5

5

0

36

0

36

-2

10

5

5

0

31

0

31

-3

10

5

5

0

26

0

26

-4

10

5

5

0

21

0

21

-5

10

5

5

0

16

0

16

-6

10

5

4

1

11

1

12

-7

10

5

3

2

7

3

10

-8

10

5

2

3

4

6

10

- Xác định LD50 của chủng S. suis serotype 2:



Tỷ lệ chết

cộng dồn

(%)

A/(A+B)x100

100

100

100

100

100

91,66

70,0

40,0



Ở độ pha loãng 10-7 gây chết 70,0 % chuột thí nghiệm, là giá trị cận trên gây chết

50%, trong khi đó giá trị cận dưới 50% ở độ pha loãng 10 -8, gây chết 40,0 % chuột thí

nghiệm.

Thay vào cơng thức ta có:

Lg LD50 = Lg



70 -



xd



50

-7



10 +



70 40



d là Lg của hệ số pha loãng = Lg10

Lg LD50 = Lg 10-7 + 0,66 x Lg 10

Vì Lg10 = 1 nên ta suy ra Lg LD50 = -7 + 0,66 x 1 = - 6,34

Tra bằng máy tính: bấm số 10 rồi nhấn vào X y, nhập -6,34 sẽ được kết quả

là: 4,57 x 10-7. Như vậy giá trị LD50 của chủng S. suis serotype 2 là 4,5 x

107CFU/0,2ml.

2. Liều LD50 của vi khuẩn S. suis serotype 7

Bảng 2: LD50 của vi khuẩn S. suis serotype 7

Các giá trị tích lũy

Độ pha

Số

Số

Số

Chuột

lỗng

Số

Số

chuột

chuột

chuộ

thí

canh

chuột chuộ

chết

sống

t

nghiệ

khuẩn

tiêm t chết

cộng

cộng

sống

m

(CFU/ml (con) (con)

dồn

dồn

(con)

(con)

)

(con)

(con)

(A)

(B)

(A+B)

-1

10

5

5

0

37

0

37

-2

10

5

5

0

32

0

32

-3

10

5

5

0

27

0

27

-4

10

5

5

0

22

0

22

-5

10

5

5

0

17

0

17

-6

10

5

4

1

12

1

13

-7

10

5

5

0

7

1

8

-8

10

5

2

3

2

4

6

- Xác định LD50 của chủng S. suis serotype 7:



Tỷ lệ chết

cộng dồn

(%)

A/(A+B)x100

100

100

100

100

100

92,30

87,50

33,33



Ở độ pha loãng 10-7 gây chết 87,50 % chuột thí nghiệm, là giá trị cận trên gây chết

50%, trong khi đó giá trị cận dưới 50% ở độ pha lỗng 10 -8, gây chết 33.33 % chuột thí

nghiệm.

Thay vào cơng thức ta có:

Lg LD50 = Lg

-7



10 +



87,50 50

87,50 –

33,33



xd



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Sơ đồ 1: Quy trình phân lập vi khuẩn S. suis (Viện Thú y Quốc gia)

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×