Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Hình 3.6: Kết quả phản ứng PCR xác định gen mã hóa độc lực của các

Hình 3.6: Kết quả phản ứng PCR xác định gen mã hóa độc lực của các

Tải bản đầy đủ - 0trang

80

gây bệnh ở lợn tại châu Âu lại có hoạt tính này. Mặc dù vậy, các chủng S. suis

serotype 2 khơng có khả năng dung huyết vẫn được xác định là có độc lực cao

(Takeuchi D. và cs., 2013) [120] Yếu tố ngoại bào EF cũng là các yếu tố độc lực

quan trọng trong sinh bệnh học của S. suis type 2 gây bệnh ở lợn và người. Các

nghiên cứu trên lợn cũng cho thấy các chủng S. suis có mang 2 yếu tố gây bệnh

MRP và EF đã được phân lập từ các phủ tạng của lợn mắc bệnh với các triệu chứng,

bệnh tích điển hình (Gottschalk M. Và cs., 2013) [69].

Kết quả của chúng tôi cũng tương đồng với kết quả của Trịnh Phú Ngọc

(2002) [12] khi nghiên cứu vi khuẩn S. suis phân lập từ lợn ở các tỉnh phía Bắc Việt

Nam cho thấy đều mang hình thái, đặc điểm sinh vật, hóa học điển hình như các tài

liệu mô tả và đã xác định được trong 449 chủng S. suis nghiên cứu có 87,5% chủng

gây dung huyết và 12,5% chủng khơng gây dung huyết, trong đó 46,0% gây dung

huyết kiểu β, kiểu γ là 32,2% và kiểu α là 21,5%. Kết quả của Đỗ Ngọc Thúy và cs.

(2009b) [32] cho thấy trong 240 chủng S. suis phân lập từ lợn tại các tỉnh miền Bắc

Việt Nam đã xác định được 7 tổ hợp gen mã hóa các yếu tố độc lực của vi khuẩn.

3.2.7. Kết quả nghiên cứu sự ổn định một số đặc tính sinh học của các chủng S. suis

phân lập được ở lợn tại Thái Nguyên

3.2.7.1. Kết quả lựa chọn sơ bộ một số chủng S. suis phân lập được

Mỗi loại vaccine được sản xuất từ một giống vi sinh vật gốc, giống vi sinh

vật này qua q trình tuyển chọn, có đủ các đặc tính sinh vật học đạt yêu cầu dùng

để làm giống cho sản xuất vaccine (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2010) [7]. Việc có

giống gốc (Master seed) và giống sản xuất (Working seed) trở thành một yêu cầu

bắt buộc về mặt kỹ thuật và về pháp lý trong sản xuất vaccine. Giống gốc là một

lượng vi khuẩn hoặc virus cụ thể đủ lớn mà sự thuần khiết, an toàn và tính kháng

ngun của chính nó và của các thế hệ sau đã được thử nghiệm, chứng minh và

được dùng làm giống để chế tạo vaccine. Vaccine được sản xuất từ giống này sau

khi được nhân lên với số lần ít nhất để đảm bảo thế hệ vi khuẩn hoặc virus trong

vaccine giữ được đặc tính của giống gốc (Thanh Hà, 2012) [5].



81

Dựa vào nguyên lý trên, chúng tôi bước đầu tiến hành thu thập các chủng vi



khuẩn S. suis cường độc gây bệnh ở lợn tại các huyện, thành thuộc tỉnh Thái

Nguyên, sau đó sàng lọc và lựa chọn một số chủng vi khuẩn S. suis đại điện

phục vụ cho tuyển chọn giống gốc để nghiên cứu chế tạo Autovaccine. Căn cứ

vào kết quả xác định gen mã hóa các yếu tố độc lực bằng phản ứng MP-PCR của

45 chủng vi khuẩn thuộc các serotype 2; 7; 9 được sàng lọc, lựa chọn và kết hợp

với kết quả xác định các đặc điểm sinh vật, hóa học của chúng, chúng tôi tiếp

tục sàng lọc và lựa chọn ra 9 chủng S. suis có đầy đủ các đặc điểm sinh vật học

của S. suis và đều mang các gen mã hoá sinh tổng hợp 4 yếu tố liên quan đến độc

lực là epf, mrp, sly và arcA để phục vụ cho nghiên cứu chế tạo thử nghiệm



Autovaccine. Kết quả được trình bày ở bảng 3.11.

Bảng 3.11: Kết quả lựa chọn sơ bộ một số chủng S. suis phân lập được

TT

1

2

3

4

5

6

7

8

9



Chủng

S. suis

S.TN2-1

S.TN2-2

S.TN2-3

S.TN7-4

S.TN7-5

S.TN7-6

S.TN9-7

S.TN9-8

S.TN9-9



Bệnh phẩm

Dịch khớp lợn

Phổi lợn

Dịch họng lợn

Dịch khớp lợn

Dịch họng lợn

Phổi lợn

Dịch khớp lợn

Phổi lợn

Dịch họng lợn



Nguồn gốc phân lập

Loại lợn

Địa điểm

Lợn con theo mẹ

Huyện Đại Từ

Lợn con sau cai sữa Huyện Phú Bình

Lợn nái ni con

Tp. Thái Ngun

Lợn nái hậu bị

Huyện Đồng Hỷ

Lợn thịt

Tp. Phổ Yên

Lợn con theo mẹ

H. Phú Lương

Lợn con sau cai sữa Thị xã Sông Công

Lợn thịt

Huyện Định Hóa

Lợn nái hậu bị

Huyện Phú Bình



Năm

2015

2015

2015

2015

2015

2015

2015

2015

2015



Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy từ các đối tượng lợn như lợn con theo mẹ,

lợn con sau cai sữa, lợn thịt, lợn nái hậu bị và lợn nái nuôi con chúng tôi đã lựa

chọn ra được 9 chủng S. suis đại diện cho các serotype gây bệnh ở lợn, gồm: 3

chủng thuộc serotype 2 (ký hiệu là: S.TN2-1, S.TN2-2, S.TN2-3); 3 chủng thuộc

serotype 7 (S.TN7-4, S.TN7-5, S.TN7-6) và 3 chủng thuộc serotype 9 (S.TN9-7,

S.TN9-8, S.TN9-9) được phân bố ở 8 huyện/thành trong tỉnh Thái Nguyên.

3.2.7.2. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng S. suis

lựa chọn sau các đời cấy truyền



82

Để lựa chọn chủng vi khuẩn làm giống cho chế tạo vaccine thì việc nghiên

cứu, đánh giá tính ổn định về đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng S. suis

qua nhiều đời nuôi cấy truyền là một yêu cầu bắt buộc để phục vụ cho nhân

giống sản xuất (Working Seed) vaccine. Lần cấy truyền thứ 4 được coi là chế tạo

giống sản xuất để chế tạo vaccine và lần cấy thứ 5 được coi là cấy để sản xuất

vaccine (Thanh Hà, 2012) [5]. Theo đó, chúng tơi đã triển khai thực hiện nuôi

cấy truyền từ các chủng vi khuẩn S. suis lựa chọn qua 5 đời liên tục trên môi

trường thạch máu cừu, ủ trong tủ ấm 37oC có 5% CO2 trong 18-24 giờ rồi lấy

khuẩn lạc để kiểm tra đặc tính sinh vật, hóa học và so sánh các đặc tính đó với đời

gốc để xác định tính ổn định của chúng qua 5 đời nuôi cấy để phục vụ cho nghiên

cứu chế tạo Autovaccine. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12.

Kết quả ở bảng trên cho thấy tất cả 9 chủng vi khuẩn S. suis được lựa chọn

sau 5 đời cấy truyền được kiểm tra đều ổn định về các đặc tính sinh vật, hóa học.

Cụ thể là trên môi trường MacConkey vi khuẩn mọc tốt và tạo thành các khuẩn lạc

màu trắng trong, lồi, nhỏ như đầu đinh ghim. Trên mơi trường thạch máu có khuẩn

lạc màu trắng trong, hơi lồi, nhỏ và gây dung huyết kiểu α, β. Tất cả các chủng vi

khuẩn kiểm tra đều có hình cầu hoặc bầu dục, xếp thành chuỗi ngắn, có khi xếp đôi

hay đơn lẻ và bắt màu Gram dương (+). Trong mơi trường canh thang có 6,5%

NaCl thì 100% chủng vi khuẩn S. suis không mọc. Với phản ứng phân hủy arganin

thấy 100% số chủng cho kết quả dương tính. Trong các mơi trường đường có 100%

các chủng lên men đường glucose, inulin, salicin, lactose, sucarose và 95,2% lên

men đường trehalose. Với glycerol, mannitol, sorbitol thì 100% chủng vi khuẩn S.

suis không lên men và 100% các chủng kiểm tra đều âm tính với các phản ứng

Catalase, Indol, Oxidase và Voges Proskauer (VP).



83

Bảng 3.12: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học cơ bản của các

chủng S. suis lựa chọn sau 5 đời cấy truyền



T

T



Đặc tính



1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

18



Gram (+)

Dung huyết

MacConkey

NaCl 6,5%

Catalase

Indol

Oxydase

Agrinin

P/ứng VP

Inulin

Salicin

Sucrose

Lactose

Trehalose

Sorbitol

Mannitol

Glycerol



Tiêu

chuẩ

n

sinh

học

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-



Serotype 2



Serotype 7



Serotype 9



S.TN

2-1



S.T

N22



S.T

N23



S.T

N74



S.T

N75



S.T

N76



S.T

N97



S.T

N98



S.T

N99



+

+

+

+

+

+

+

+

+

-



+

+

+

+

+

+

+

+

+

-



+

+

+

+

+

+

+

+

+

-



+

+

+

+

+

+

+

+

+

-



+

+

+

+

+

+

+

+

+

-



+

+

+

+

+

+

+

+

+

-



+

+

+

+

+

+

+

+

+

-



+

+

+

+

+

+

+

+

+

-



+

+

+

+

+

+

+

+

+

-



Như vậy, các chủng vi khuẩn S. suis phân lập từ lợn tại Thái Nguyên sau 5

đời cấy truyền được kiểm tra đều thấy ổn định về đặc tính sinh vật, hóa học và phù

hợp với các tiêu chí đánh giá theo Quy trình chẩn đốn bệnh do vi khuẩn S. suis

gây ra trên lợn (TCVN 8400-2:2010) [36]. Đây là những đặc tính quan trọng của

một giống gốc vi khuẩn để trong quá trình nhân giống sản xuất vaccine bởi có thể

đảm bảo và giữ nguyên được các đặc tính sinh vật học của chúng qua các lô giống

khác nhau.

3.2.7.3. Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng vi khuẩn S. suis lựa chọn sau

các đời cấy truyền

Dựa vào kết quả xác định đặc tính sinh vật, hóa học của 9 chủng vi khuẩn



S. suis gốc thuộc serotype 2; 7 và 9 được nuôi cấy truyền qua 5 đời liên tục trên



84

môi trường thạch máu cừu, chúng tôi tiến hành kiểm tra độc lực của chúng trên

chuột bạch. Chuột thí nghiệm được tiêm 0,5 ml canh trùng/con (tương đương ~2 x

106 vi khuẩn/chuột) nuôi cấy ở 37 oC/24 giờ vào phúc xoang. Chuột thí nghiệm

được theo dõi thời gian chết trong vòng 7 ngày. Tất cả các chuột chết được mổ

khám, kiểm tra triệu chứng, bệnh tích và phân lập lại vi khuẩn từ máu tim. Kết quả

được trình bày ở bảng 3.13.

Bảng 3.13: Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng S. suis

trên chuột bạch sau 5 đời cấy truyền



TT



Ký hiệu

chủng



Thuộc

serotype



Số

chuột

tiêm

(con)



Liều

tiêm

(ml/

con)



Kết quả

Số

chuột

chết

(con)



Thời

gian

chết

(giờ)



Phân

lập

Tỷ

lại

lệ

(%) VK



1



S.TN2-1



2



2



0,5



2/2



18 – 24



100



+



2



S.TN2-2



2



2



0,5



2/2



12 – 24



100



+



3



S.TN2-3



2



2



0,5



2/2



12 – 24



100



+



4



S.TN7-4



7



2



0,5



1/2



< 48



50



+



5



S.TN7-5



7



2



0,5



2/2



24 – 36



100



+



6



S.TN7-6



7



2



0,5



1/2



< 36



50



+



7



S.TN9-7



9



2



0,5



2/2



12 – 24



100



+



8



S.TN9-8



9



2



0,5



2/2



18 – 24



100



+



9



S.TN9-9



9



2



0,5



2/2



18 – 24



100



+



Qua bảng 3.13 cho thấy sau 5 đời cấy truyền các chủng vi khuẩn S. suis

thuộc serotype 2 đều gây chết 100% số chuột thí nghiệm trong thời gian sau tiêm

24 giờ, trong đó có 2/3 (66,67%) chủng gây chết chuột từ 12 – 24 giờ và 1/3

(33,33%) chủng từ 18 – 24 giờ. Các chủng S. suis serotype 9 cũng gây chết 100%

số chuột thí nghiệm trong khoảng thời từ 12 – 24 giờ, trong đó có 1/3 (33,33%)

chủng gây chết chuột từ 12 – 24 giờ và 2/3 (66,67%) chủng từ 18 – 24 giờ. Trong

khi đó, chỉ có 1/3 (33,33%) chủng thuộc serotype 7 được kiểm tra gây chết 100%

số chuột thí nghiệm sau tiêm từ 24 – 36 giờ, và 2/3 (66,67%) chủng gây chết 50%

chuột trong vòng trước 36 – 48 giờ sau khi tiêm. Qua kết quả trên chúng tôi thấy



85

các chủng S. suis serotype 2 và 9 có độc lực cao, đều gây chết chuột bạch thí

nghiệm trong thời gian ngắn.

Tất cả các chuột thí nghiệm chết được mổ khám để kiểm tra bệnh tích đều cho

thấy có bệnh tích tương đối giống nhau như chỗ tiêm đơi khi có hiện tượng áp xe,

phổi viêm và sung huyết; tim xưng, mềm, tích nước ở xoang bao tim. Khi tiến hành

phân lập lại vi khuẩn thì đều thu được S. suis thuần khiết từ máu tim. Kết quả của

chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của Khương Thị Bích Ngọc (1996) [10] khi

tiêm 0,2ml vi khuẩn S. suis vào dưới da cho chuột bạch thấy chuột chết sau 12 – 48

giờ, chỗ tiêm bị áp xe có mủ và phân lập lại được vi khuẩn thuần khiết từ máu tim.

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2017) [17] kiểm tra độc lực của các

chủng S. suis phân lập ở lợn tại tỉnh Bắc Ninh trên chuột bạch, tiêm 0,2 ml canh

trùng nuôi ở 37°C/24 giờ vào phúc xoang có 95,45% số chuột chết sau tiêm 36 giờ.

Kết quả của Nguyễn Văn Quang và cs. (2017) [26] khi xác định độc lực của các

chủng S. suis phân lập ở lợn tại tỉnh Tuyên Quang cũng thấy có độc lực cao, gây

chết 97,11% chuột thí nghiệm sau tiêm 48 giờ.

Như vậy, có thể thấy các chủng thuộc serotype 2, 7 và 9 là ba loại serotype

chiếm ưu thế trong số các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được từ lợn viêm phổi và

viêm khớp tại Thái Nguyên là những chủng có độc lực cao và có thể gây chết chuột

trong thời gian ngắn sau 5 đời cấy truyền. Đây là một đặc tính rất quan trọng cho

việc sàng lọc và lựa chọn các chủng vi khuẩn để chế tạo autovaccine.

Dựa vào công thức tính liều gây chết 50% (LD 50) của Reed L.J & Muench H.

(1938) [104] chúng tôi tiến hành xác định được liều LD50 của các chủng vi khuẩn S.

suis phân lập được, kết quả xác định liều LD 50 của S. suis serotype 2 là LD50 = 4,5 x

107; serotype 7 là LD50 = 4,9 x 107 và serotype 9 là LD50 = 4,8 x 107.

3.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Autovaccine từ các chủng S. suis

phân lập được

3.3.1. Chọn chủng vi khuẩn S. suis để chế tạo thử nghiệm Autovaccine

Từ các kết quả nghiên cứu về xác định đặc tính sinh vật, hóa học, xác định

serotype, gen mã hóa các yếu tố độc lực và độc lực của 9 chủng vi khuẩn S. suis

phân lập được ở lợn mắc viêm phổi và viêm khớp tại tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi



86

đã lựa chọn được 3 chủng vi khuẩn S. suis đại diện cho các serotype 2, 7 và 9 (ký

hiệu là: S.TN2-2, S.TN7-5 và S.TN9-7) để chế tạo thử nghiệm Autovaccine vơ hoạt

có bổ trợ keo phèn. Đặc tính của các chủng S. suis được lựa chọn để chế tạo thử

nghiệm Autovaccine được trình bày tại bảng 3.14.

Bảng 3.14: Đặc tính của các chủng S. suis được lựa chọn để chế tạo

thử nghiệm Autovaccine

TT

1

2

3



Ký hiệu

chủng

S.TN2 – 2

S.TN7 – 5

S.TN9 – 7



Nguồn gốc



Serotype



Phổi lợn

Dịch họng lợn

Dịch khớp lợn



2

7

9



Gen các yếu tố

gây bệnh

arc, mrp, epf, sly

arc, mrp, epf, sly

arc, mrp, epf, sly



Thời gian

gây chết

chuột (giờ)

12 – 24

24 – 36

12 – 24



Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy 3 chủng vi khuẩn S. suis lựa chọn sử dụng làm

giống gốc để chế tạo Autovaccine thử nghiệm được sàng lọc và lựa chọn trong số

các serotype chiếm tỷ lệ cao phân lập được ở lợn mắc viêm phổi và viêm khớp tại

Thái Nguyên. Cả 3 chủng này đều có đầy đủ các đặc tính sinh vật, hóa học của vi

khuẩn S. suis và mang 4 gen mã hóa các yếu tố độc lực, bao gồm yếu tố ngoại bào

(EF - epf), protein giải phóng muramidase (MRP - mrp), yếu tố gây dung huyết

suilysin (SLY - sly) và enzym arginine deiminase (ARC - arcA) là các gen tạo nên

các độc tố đóng vai trò quan trọng trong gây bệnh ở lợn. Các chủng vi khuẩn trên

đều có độc lực cao, gây chết chuột thí nghiệm trong vòng 12 - 36 giờ. Đây là 3

chủng có đủ các yêu cầu và tiềm năng nhất sử dụng làm giống để chế tạo

Autovaccine so với các chủng còn lại.

Do S. suis có độc lực thường xâm nhập và gây viêm phổi, viêm khớp ở lợn

con nên kết hợp các serotype đặc trưng, phổ biến phân lập được trong đàn và sử

dụng chúng để chế tạo vaccine chuồng được xem là biện pháp phòng bệnh hữu

hiệu. Một số nhà khoa học đã chứng minh việc tiêm vaccine cho lợn con chế tạo từ

các chủng vi khuẩn S. suis với các serotype đặc trưng của đàn sẽ mang lại hiệu quả

cao hơn về giảm tỷ lệ lợn mắc bệnh và chết (Dutkiewicz J. và cs, 2018) [59].

Một số nghiên cứu đã cho thấy lợn được bảo vệ tốt bởi các vaccine được chế

tạo từ nhiều loại protein của S. suis serotype 2. Loại vaccine sử dụng protein EF và



87

MRP của S. suis có thể bảo vệ lợn chống lại yếu tố độc lực từ chủng S. suis

serotype 2 (Higgins R. và Gottschalk M., (2006) [77]. Trong khi đó, khi tiêm

vaccine chế tạo từ một chủng liên cầu khuẩn có suilysin và độc lực cho lợn có

thể tạo ra kháng thể trung hòa suilysin nhưng cũng khơng bảo vệ được cơ thể

chống lại đồng loại hay dị loại protein EF và MRP (Baums C.G. và cs, 2009)

[45], những kết quả trên có thể là do sử dụng các chủng S. suis khác nhau trong

nghiên cứu, bởi không phải tất cả các chủng S. suis có độc lực đều chứa EF và

MRP hoặc suilysin (Segura M. và cs,, 2015) [111].

3.3.2. Chế tạo thử nghiệm Autovaccine phòng bệnh S. suis ở lợn

3.3.2.1. Kết quả nuôi cấy canh trùng để chế tạo Autovaccine thử nghiệm:

Vi khuẩn S. suis phát triển chậm trên các môi trường nuôi cấy thông thường

nên thường phải ni cấy trong mơi trường giàu dinh dưỡng và có bổ sung 5 – 10%

CO2 trong tủ ấm. Vi khuẩn S. suis phát triển tốt trên môi trường thạch máu

Columbia, nước thịt BHI nên được chúng tôi lựa chọn để ni cấy vi khuẩn S. suis

trong điều kiện thích hợp dùng chế tạo Autovaccine phòng bệnh.

Các chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2, 7 và 9 lựa chọn để chế tạo

Autovaccine thử nghiệm được nuôi cấy riêng từng chủng, sử dụng ni cấy lắc

(300 – 500 lần/phút) trong vòng 24 giờ, đạt độ đậm tối thiểu trong 1 ml canh trùng

dùng chế Autovaccine thấp nhất là 1,5 x 10 8 vi khuẩn. Sau đó được vơ hoạt bằng

formalin để diệt vi khuẩn với tỷ lệ 0,3%, rồi trộn lẫn canh trùng theo tỷ lệ 1:1:1 và

bổ sung keo phèn với tỷ lệ 1/5 (20%) theo Quy trình sản xuất vaccine vô hoạt bổ

trợ keo phèn của Viện thú y Quốc gia. Thực hiện quy trình nhân giống sản xuất

vaccine như trên, kết quả thu được 3 lô Autovaccine (1,5 lít/lơ) được ký hiệu là Lơ

I, Lơ II và Lơ III. Mỗi lô Autovaccine chứa canh trùng hỗn hợp của các serotype 2,

7 và 9 thuộc vi khuẩn S. suis đã lựa chọn. Để kiểm nghiệm Autovaccine thử

nghiệm, sử dụng quy trình kiểm nghiệm vaccine chết có bổ trợ keo phèn theo

QCVN-01-187 : 2018 [27] và TCVN 8685: 2018 [38].

Các serotype vi khuẩn S. suis được nuôi cấy riêng trong các bình khác nhau,

khi ni có lắc (300 – 500 lần/phút) sau thời gian 24 giờ. Đến giai đoạn giống cấp

III, tiến hành lấy mẫu để kiểm tra độ đậm của vi khuẩn có trong 1 ml của từng loại



88

canh trùng bằng phương pháp đếm số lượng vi khuẩn trên mơi trường thạch máu.

Kết quả được trình bày ở bảng 3.15.

Bảng 3.15: Kết quả đếm số lượng vi khuẩn có trong canh trùng S. suis

dùng chế tạo Autovaccine thử nghiệm

Số vi khuẩn/1 ml canh trùng



Tính

chung

số lượng

VKTB/1ml





Autovaccine



CT

CT2



CT7



CT9



Số lượng



Số lượng



Số lượng



VKTB/1ml



VKTB/1ml



VKTB/1ml



CT

CT

CT

8

8

Lơ I (1,5 lít)

1,65 x 10

1,63 x 10

1,64 x 108

1,64 x 108

Lơ II (1,5 lít)

1,71 x 108

1,68 x 108

1,69 x 108

1,69 x 108

Lơ III (1,5 lít)

1,72 x 108

1,70 x 108

1,71 x 108

1,71 x 108

Ghi chú: CT: Canh trùng, CT2: Canh trùng S. suis serotype 2; CT7: Canh trùng S.

suis serotype 7; CT9: Canh trùng S. suis serotype 9; VKTB: Vi khuẩn trung bình.

Kết quả ở bảng 3.15 cho thấy sau thời gian nuôi cấy các lô canh trùng của ba

lô Autovaccine thử nghiệm chế tạo thử từ các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được

đều có độ đậm vi khuẩn trung bình đạt từ 1,64 x 10 8 đến 1,71 x 108 vi khuẩn/ml.

Theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia (QCVN-01-187:2018) [27] yêu cầu số

lượng vi khuẩn phải có trong 1 ml canh trùng để chế vaccine phải đạt thấp nhất

là 1,5 x 10 8 vi khuẩn/ml thì các lơ canh trùng trên dùng chế tạo Autovaccine

thử nghiệm đều đủ tiêu chuẩn.

Hiện nay ở Việt Nam chưa có tiêu chuẩn cho vaccine phòng bệnh liên cầu

khuẩn S. suis nên trong nghiên cứu này chúng tôi đã dựa vào kết quả nghiên cứu

của Torremorell M. (1997) [122] khi sử dụng vaccine vô hoạt bởi 0,2%

formaldehyde có bổ trợ nhũ dầu chế tạo từ vi khuẩn S. suis serotype 2 phân lập ở

lợn với độ đậm vi khuẩn là 4,0 × 108 CFU/ml đã cho hiệu quả phòng bệnh để tính

số lượng vi khuẩn trong 1 liều Autovaccine chế tạo thử nghiệm phòng viêm phổi và

viêm khớp do S. suis cho lợn nuôi tại Thái Ngun. Theo đó, với độ đậm trung bình



89

của 3 lô Autovaccine được chế tạo thử nghiệm là 1,68 x 10 8 CFU/ml, sau khi bổ

sung keo phèn chúng tơi đã tính được liều tiêm Autovaccine cho lợn là 2,5 ml/con,

tương đương với độ đậm vi khuẩn trung bình khoảng: 4,2 x 10 8 CFU/ml.

3.3.2.2. Kết quả kiểm tra thuần khiết canh trùng S. suis dùng chế tạo Autovaccine thử nghiệm

Việc kiểm tra thuần khiết của canh trùng S. suis serotype 2, 7 và 9 trong quá

trình chế tạo autovaccine được tiến hành đồng thời với các bước nuôi cấy canh

trùng riêng của từng chủng vi khuẩn S. suis từ giống nhỏ đến giống lớn như mô tả ở

phần phương pháp theo Quy trình sản xuất vaccine vơ hoạt bổ trợ keo phèn của

Viện thú y Quốc gia. Kết quả được trình bày ở bảng 3.16.

Bảng 3.16: Kết quả kiểm tra thuần khiết của canh trùng

dùng chế tạo Autovaccine thử nghiệm

Mơi trường

Nước thịt thường

Nước thịt gan

yếm khí

Thạch máu

Thạch

MacConkey



Lơ I

Thuần khiết



Kết quả kiểm tra

Lô II

Lô III

Thuần khiết

Thuần khiết



(3/3)

Thuần khiết



(3/3)

Thuần khiết



(3/3)

Thuần khiết



(3/3)

Thuần khiết



(3/3)

Thuần khiết



(3/3)

Thuần khiết



(3/3)

Thuần khiết



(3/3)

Thuần khiết



(3/3)

Thuần khiết



(3/3)



Đánh

giá

Đạt

Đạt

Đạt



Đạt

(3/3)

(3/3)

Ghi chú: (3/3): 3 chủng vi khuẩn S. suis



Qua bảng 3.16 cho thấy, canh trùng dùng để chế tạo ba lô autovaccine thử

nghiệm đều đạt các chỉ tiêu về thuần khiết. Trên các môi trường như nước thịt

thường, nước thịt gan yếm khí, thạch máu, thạch MacConkey nuôi cấy với 3 chủng

vi khuẩn S. suis khác nhau (S.TN2-2, S.TN7-5 và S.TN9-7), theo dõi trong 72 giờ

ngày. Kết quả cho thấy ở cả 3 lô canh trùng giống autovaccine thử nghiệm I, II và

III đều chỉ thấy có duy nhất vi khuẩn S. suis phát triển.

3.3.3. Kết quả kiểm nghiệm Autovaccine phòng bệnh S. suis ở lợn

3.3.3.1. Kết quả kiểm tra vô trùng Autovaccine chế tạo từ các chủng S. suis



90

Trong quá trình nghiên cứu chế tạo autovaccine thử nghiệm, sau khi vô hoạt

vi khuẩn trong canh trùng bằng formalin 0,3%, ủ ở tủ ấm 37 0C/24 giờ, tiến hành

kiểm tra vô trùng bằng cách nuôi cấy trên các loại môi trường khác nhau. Các bình

canh khuẩn của từng chủng vi khuẩn S. suis sau khi được kiểm tra và đạt các chỉ

tiêu về thuần khiết thì được tập trung vào một bình lớn và bổ sung keo phèn với tỷ

lệ 1/5. Trộn đều canh khuẩn và keo phèn, sau đó lấy mẫu canh trùng hỗn hợp để

kiểm tra thuần khiết và vô trùng, được áp dụng theo Tiêu chuẩn quốc gia: Vaccine

và chế phẩm sinh học dùng trong thú y (TCVN 8684:2011) [37]. Các lô canh trùng

hỗn hợp sau khi được kiểm tra về chỉ tiêu về thuần khiết sử dụng phương pháp

nhuộm Gram để xác định chỉ có S. suis trong thành phần thì được tiếp tục kiểm tra

về chỉ tiêu vơ trùng. Lấy 0,2 ml canh trùng hỗn hợp ở các lô cấy vào các môi

trường quy định để kiểm tra như môi trường nước thịt, nước thịt TYE và nước thịt

gan yếm khí, thạch máu, thạch MacConkey, thạch PPLO, thạch Sabouraud. Mỗi

loại môi trường cấy kiểm tra 3 ống, được bồi dưỡng ở tủ ấm 37 oC có bổ sung 5%

CO2, riêng thạch nấm thì để ở nhiệt độ phòng. Theo dõi kết quả hàng ngày, mỗi

ngày đọc kết quả một lần, sau 7 ngày (riêng môi trường nấm theo dõi 14 ngày) nếu

khơng có vi khuẩn nào mọc trên các mơi trường kiểm tra thì autovaccine đạt tiêu

chuẩn vơ trùng. Kết thu được trình bày ở bảng 3.17.

Bảng 3.17: Kết quả kiểm tra vô trùng của Autovaccine chế tạo thử nghiệm

Các giai

đoạn



Môi trường

kiểm tra



Nước thịt

Nước thịt TYE

Canh trùng Nước thịt gan yếm

sau khi vơ khí

hoạt bằng Thạch máu

formalin

Thạch MacConkey

Thạch PPLO

Thạch Sabouraud



Lô I

Lô II

Lô III

Số ống Kết Số ống Kết Số ống Kết

MTK qu MTK qu MTK qu

T



T



T



3

3

3

3

3

3

3



-



3



-



3



-



3

3

3

3



-



3

3

3

3



-



3

3

3

3



-



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Hình 3.6: Kết quả phản ứng PCR xác định gen mã hóa độc lực của các

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×