Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

46

- Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh ở lợn do vi khuẩn S. suis gây ra.

2.2. Đối tượng, nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Vi khuẩn S. suis gây bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn phân lập được.

- Autovaccine S. suis phòng bệnh viêm phổi, viêm khớp lợn.

2.2.2. Nguyên vật liệu

2.2.2.1. Bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm là phổi, dịch họng, dịch khớp của lợn ốm hoặc chết có các

triệu chứng, bệnh tích nghi mắc viêm phổi hoặc bệnh nghi do vi khuẩn S. suis như

sốt, bỏ ăn, khó thở, ho, sưng khớp, bại liệt, thần kinh...

2.2.2.2. Động vật thí nghiệm

- Chuột bạch khoẻ mạnh (18 - 20 gam/con).

- Lợn con 5 - 6 tuần tuổi, khỏe mạnh chưa được tiêm phòng bệnh viêm

phổi, viêm khớp chế từ vi khuẩn S. suis.

2.2.2.3. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu

- Các loại mơi trường dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn do hãng Oxoid

(Anh) và Merck (Pháp) sản xuất. Môi trường phân lập vi khuẩn như thạch BHI

(Brain heart infusion) có bổ xung 5% máu cừu hoặc bê; Canh thang Trypticase soy

(TSI), thạch TSA (Tryptone soya agar) 6,5% NaCl, TSB (Tryptone soya broth) có bổ

sung 1 - 3% fresh Yeast Extract; nước thịt TYE (Tryptone Yeast Extract Broth),

MacConkey, Columbia, Thạch PPLO (có bổ sung NAD)...

- Các loại mơi trường, hóa chất dùng để xác định một số đặc tính sinh

hóa của vi khuẩn: canh thang 6,5% NaCl, Arginin, Voges Proskauer, Inulin,

Salicin, Trehalose, Lactose, Sucarose, Sorbitol...

- Bộ Kit sinh hóa API 20 Strep dùng để xác định các đặc tính sinh hố và

định danh vi khuẩn S. suis (BioMe’rieux, Marcy l’Etoile, France).

- Giấy tẩm kháng sinh do hãng Oxoid (Anh) sản xuất.

- Các loại hoá chất và sinh phẩm dùng cho các phản ứng ngưng kết, huyết

thanh học và kỹ thuật PCR, phản ứng IHA..



47

- Các loại thuốc kháng sinh như Cefanew-LA, Marflo-45%, Marphamox-LA

và thuốc trợ sức Gluco-K-C-Namin do Công ty thuốc thú y Marphavet sản xuất.

2.2.2.4. Giống vi khuẩn

Chủng vi khuẩn S. suis chuẩn và các huyết thanh chuẩn tương ứng do Trung

tâm chẩn đoán thú y trung ương, Cục Thú y cung cấp, sử dụng làm chủng tham

chiếu với các chủng vi khuẩn phân lập được trong phản ứng PCR và huyết thanh học.

2.2.2.5. Máy móc, dụng cụ thí nghiệm

Các dụng cụ thí nghiệm thơng dụng, buồng cấy vơ trùng, nồi hấp, máy ly

tâm, máy lắc giàn, máy dùng cho phản ứng PCR... dùng cho các nghiên cứu về vi

trùng thuộc Trung tâm Chẩn đoán Thú y trung ương, Cục Thú y và Viện Khoa học

Sự sống, Đại học Thái Nguyên.

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.3.1. Địa điểm nghiên cứu

- Các trang trại và gia trại chăn nuôi lợn tại các huyện, thành thuộc tỉnh

Thái Nguyên có lợn nghi mắc bệnh liên cầu khuẩn S. suis.

- Bộ môn Vi trùng, Trung tâm Chẩn đoán thú y trung ương, Cục Thú y.

- Viện Khoa học Sự sống, Đại học Thái Nguyên.

2.3.2. Thời gian nghiên cứu

- Từ năm 2015 đến năm 2018.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ

Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả, dịch tế học phân tích và

dịch tễ học thực nghiệm của Nguyễn Như Thanh, (2001) [30].

Phương pháp nghiên cứu cắt ngang tìm căn nguyên của bệnh, so sánh tần

suất bệnh giữa các nhóm khác nhau. Các cá thể trong cùng nhóm cũng như các yếu

tố nguy cơ và các thông tin khác đều được tiến hành trong cùng một thời gian, thời

điểm nghiên cứu.

2.4.1.1. Chọn mẫu điều tra

Sử dụng phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc, điều tra ngẫu nhiên ở các

huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên, mỗi huyện nghiên cứu ở 3 - 5 xã, mỗi xã thực hiện



48

ở 3 - 5 thơn có ni nhiều lợn sinh sản. Các địa điểm triển khai điều tra mang tính

đại diện tương đối về tự nhiên như thời tiết, địa lý, sinh thái.

2.4.1.2. Phương pháp điều tra

- Trực tiếp quan sát để phát hiện lợn mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp.

+ Những lợn có triệu chứng sốt, ho, khó thở, kém hoặc bỏ ăn nghi mắc viêm phổi.

+ Những lợn có triệu chứng sốt, ăn ít hoặc bỏ ăn, sưng khớp chân, đi khập

khiễng, bại liệt, run rẩy nghi mắc bệnh do vi khuẩn S. suis.

- Phỏng vấn chủ hộ chăn nuôi về những thông tin cần thiết.

- Thông tin điều tra được ghi vào các phiếu điều tra.

2.4.1.3. Nội dung điều tra, theo dõi

Số lợn mắc bệnh, chết do bệnh viêm phổi, viêm khớp tại các hộ, các trang

trại chăn nuôi, phân loại theo địa bàn từng huyện điều tra và theo lứa tuổi của lợn.

2.4.1.4. Các phương pháp đo lường trong dịch tễ

Số con mắc bệnh

Tổng số lợn điều tra



- Tỷ lệ lợn mắc bệnh (%) =



- Tỷ lệ chết do mắc bệnh (%)



- Tỷ lệ khỏi bệnh (%) =



x 100



Số con chết do bệnh

x 100

Tổng số lợn mắc bệnh



Số con sống (khơng có triệu chứng của bệnh)



x 100

Tổng số con điều trị

Ghi chú: Lợn sau khi được điều trị khơng còn các triệu chứng của bệnh được



xem là lợn đã khỏi bệnh.

- Hiệu lực tiêm phòng được tính theo phương pháp của Halloran và cs.

(1997) [72], vaccine có khả năng bảo hộ cho lợn và có thể đưa vào ứng dụng trong

thực tế khi có hiệu lực tiêm phòng > 60%.

Hiệu lực tiêm phòng (%) =

(1 -



Số con mắc bệnh/Số con tiêm vaccine

Số con mắc bệnh/Số con không tiêm

vaccine



) x 100



49

2.4.2. Phương pháp thu thập mẫu

- Bệnh phẩm là dịch họng, dịch ổ khớp: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy

sâu vào trong họng, ngoáy vào dịch ổ khớp viêm của lợn ốm sau đó cho vào ống

đựng tăm bơng, bảo quản ở 4oC và chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 4 - 6

giờ.

- Bệnh phẩm là phổi của những lợn ốm hoặc chết có triệu chứng, bệnh tích

nghi mắc bệnh do vi khuẩn S. suis được cho riêng rẽ vào các túi nylon vô trùng,

bảo quản lạnh ở 4oC và đưa ngay về phòng thí nghiệm trong vòng 4 – 6 giờ để tiến

hành ni cấy và phân lập vi khuẩn.

2.4.3. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S. suis

Các mẫu bệnh phẩm được ria cấy trên các loại môi trường như nước thịt,

thạch máu, thạch MacConkey và môi trường đặc hiệu thạch máu Columbia. Bệnh

phẩm trước khi ria cấy vào các môi trường phải dùng bơng tẩm cồn đốt mặt ngồi

để diệt tạp khuẩn. Sau đó dùng kéo đã được sát trùng cẩn thận cắt sâu vào bên trong

phần đã đốt, lấy một mẩu nhỏ các mô, rồi phết lên mặt các loại môi trường thạch,

đồng thời cho vào môi trường nước thịt, bồi dưỡng ở tủ ấm 37 oC trong 24 giờ. Căn

cứ vào tính chất mọc và hình thái của khuẩn lạc trên các môi trường sẽ tiến hành

chọn khuẩn lạc nghi là S. suis, cấy chuyển sang thạch máu và thạch máu Columbia

mới để có thể thực hiện các phản ứng nhận biết cấp I, cấp II, xác định một số yếu tố

gây bệnh và serotype của vi khuẩn và cấy giữ giống để dùng cho các nghiên cứu

tiếp theo.

Các phương pháp nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn được thực hiện

theo Quy trình của Viện Thú y Quốc gia (Phụ lục 3).

2.4.4. Phương pháp kiểm tra hình thái vi khuẩn bằng nhuộm Gram

Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần kiểm tra được tiến hành phết lên phiến

kính, cố định, rồi nhuộm theo phương pháp nhuộm Gram. Kiểm tra hình thái vi

khuẩn dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1.000 lần. Vi khuẩn S. suis bắt màu Gram

dương (+), có hình cầu hoặc hình trứng, đứng từng đơi hoặc xếp thành các chuỗi

ngắn (Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-2:2010 [36].



50

2.4.5. Phương pháp thực hiện các phản ứng sinh hóa (Nhận biết cấp I)

Thực hiện theo Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-2:2010 [36].

- Kiểm tra khả năng dung huyết: Quan sát khả năng làm tan huyết xung

quanh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần kiểm tra sau khi đã nuôi cấy trên đĩa thạch

máu cừu, ủ ở tủ ấm 37 oC (5% CO2) qua đêm rồi đọc kết quả. Dung huyết kiểu α:

vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc có màu xanh (dung huyết từng phần hay

dung huyết khơng hoàn toàn). Dung huyết kiểu β: Bao quanh khuẩn lạc là một

vùng tan máu hồn tồn trong suốt, có bờ rõ ràng do Hemoglobin bị phân huỷ hoàn

toàn. Dung huyết kiểu γ (còn gọi là khơng dung huyết): khơng làm biến đổi thạch máu.

- Phản ứng với KOH: Dùng que cấy nhựa, phết khuẩn lạc của vi khuẩn S.

suis mọc trên mơi trường thạch máu lên một phiến kính sạch. Sau khi nhỏ 1 giọt

dung dịch KOH 3% nếu không thấy có hiện tượng tạo thành lớp keo dính giữa

khuẩn lạc và thuốc thử trong vòng 60 giây thì chủng vi khuẩn kiểm tra được đánh

giá là phản ứng âm tính. Vi khuẩn S.suis cho phản ứng với KOH 3% âm tính.

- Phản ứng Catalase: Thực hiện tương tự như trong phản ứng với KOH, chỉ

khác là thay thuốc thử KOH 3% bằng dung dịch H 2O2 3%. Nếu không quan sát thấy

hiện tượng sủi bong bóng trong vòng vài giây thì chủng vi khuẩn kiểm tra sẽ được đánh

giá là có phản ứng Catalase âm tính. Vi khuẩn S. suis cho phản ứng Catalase âm tính.

- Kiểm tra khả năng phát triển trong mơi trường canh thang có 6,5% NaCl:

chủng vi khuẩn cần kiểm tra được cấy vào môi trường canh thang có 6,5% NaCl.

Sau khi ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ, nếu quan sát mà không thấy mơi trường có

hiện tượng đục là phản ứng âm tính. Vi khuẩn S. suis khơng phát triển trong mơi

trường canh thang có 6,5% NaCl (phản ứng âm tính).

2.4.6. Phương pháp thực hiện bộ Kit sinh hóa API 20 Strep (Nhận biết cấp II)

Sau khi thực hiện phản ứng nhận biết cấp I, chỉ các chủng vi khuẩn được kết

luận là S. suis mới được tiến hành các phản ứng với bộ Kit sinh hóa API 20 Strep.

Thực hiện bộ Kit này với các chủng vi khuẩn đã được xác định là S. suis nhằm mục

đích là định danh, giám định vi khuẩn S. suis và nghiên cứu một số đặc tính sinh

vật hố học của chúng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.



51

Bộ Kit sinh hóa API 20 Strep gồm 20 phản ứng đã được chế sẵn trong một

khay nhựa do hãng BioMérieux, France sản xuất, bao gồm: VP, HIP. ESC, PYRA,

αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP, ADH, RIB, ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU,

RAF, AMD, GLYG.

Cách tiến hành: Mỗi chủng vi khuẩn cần kiểm tra được cấy thành lớp dày

đặc trên mặt đĩa thạch máu Columbia, nuôi cấy ở 37 oC/24 giờ (5% CO2). Dùng tăm

bông vô trùng lấy vi khuẩn từ đĩa thạch, rồi hòa tan vào 2 ml nước cất vô trùng để

đạt được độ đục tương đương với ống số 4 của dãy so độ đục chuẩn McFarland.

Trong khay nhựa có chứa các loại thuốc thử, tiến hành nhỏ 100µl huyễn dịch này

vào mỗi lỗ đối với các phản ứng từ VP đến ADH. Phần huyễn dịch còn lại được

trộn đều với 1 ampule mơi trường API GP có sẵn trong bộ kit thử và nhỏ vào các lỗ

còn lại, từ RIB đến GLYG. Tồn bộ khay nhựa có chứa các phản ứng được đặt vào

một giá nhựa có chứa khoảng 5 ml nước cất bên dưới để làm ẩm. Ủ ở tủ ấm 37 oC.

Sau 4 giờ, nhỏ các thuốc thử thích hợp: nhỏ vào giếng VP: 1 giọt vào giếng VP 1 và

1 giọt VP 2 đối với phản ứng VP, nhỏ 2 giọt NIN đối với phản ứng HIP, nhỏ vào

giếng từ PYRA đến LAP: 1 giọt ZYM A và 1 giọt ZYM B đối với các phản ứng

PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL và LAP.

Cách đọc kết quả: Đọc kết quả lần 1 sau 10 phút và đọc kết quả lần 2 sau 20

giờ từ khi đọc kết quả lần 1. Các phản ứng đánh giá là dương tính hay âm tính dựa

vào bảng so màu sẵn được cung cấp bởi nhà sản xuất, tính điểm và mã hóa bằng

các chữ số. Kết quả thực hiện của mỗi chủng vi khuẩn sẽ được hiển thị bằng một

dãy gồm 7 chữ số. Tra bảng nhận biết để có thể kết luận là chủng vi khuẩn kiểm tra

thuộc loại vi khuẩn nào, được định danh bằng cách tra theo phần mềm API 20 Strep

của nhà sản xuất.

2.4.7. Phương pháp PCR để xác định các serotype gây bệnh thơng thường và các

gen mã hố một số yếu tố độc lực của vi khuẩn S. suis

- Các chủng vi khuẩn S.suis sau khi được xác định các đặc tính sinh vật

học, được tiến hành xác định 1 trong 4 serotype (serotype 1, 2, 7 và 9) thường gặp

gây bệnh ở lợn bằng phản ứng PCR. Trong trường hợp nếu chúng vẫn không thuộc



52

về các serotype được thực hiện như trong phản ứng PCR thì sẽ được tiến hành định

serotype lần lượt với 30 loại kháng huyết thanh. Các chủng vi khuẩn sau khi được

xác định chắc chắn là S. suis bằng phương pháp PCR được tiếp tục thực hiện phản

ứng Multiplex PCR (MP-PCR) để xác định một số yếu tố độc lực gây bệnh

chính.Thí nghiệm này được thực hiện tại Bộ môn Vi trùng thuộc Trung tâm chẩn

đoán Thú y trung ương, Cục Thú y (chi tiết trình bày ở Phụ lục 4 và 5).

2.4.8. Phương pháp tính liều gây chết 50% (LD50) của vi khuẩn S. suis

Cơng thức tính LD50 theo Reed L.J. & Muench H. (1938) [104]. Cách tiến

hành: canh trùng S. suis bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ và được pha loãng hệ số 10

từ 10-1 đến 10-10, mỗi nồng độ tiêm cho 5 chuột bạch với liều 0,2 ml canh trùng/con,

tính số chuột sống và số chuột chết theo phương pháp cộng dồn.



LgLD50 = LgA +



a − 50

×d

a−b



Trong đó: A là nồng độ pha loãng gây chết cận trên 50% chuột; a là tỷ lệ

chuột chết do liều A gây ra (%); b là tỷ lệ chuột chết do liều B gây ra (%) (cộng

dồn) với nồng độ pha loãng gây chết cận dưới 50% chuột; d là lg của nồng độ pha

lỗng. Cách tính liều gây chết LD50 được trình bày chi tiết ở Phụ lục 8.

2.4.9. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn

TheoTCCS-01:2018/VTCĐ [35] của Phòng Vi trùng, Trung tâm chẩn



đoán Thú y trung ương, Cục Thú y. Mẫu canh khuẩn cần xác định được lấy vơ

trùng sau đó pha lỗng canh khuẩn với nước muối sinh lý vơ trùng thành các độ

pha loãng khác nhau từ 10 - 1 đến 10 - 8. Dùng 3 độ pha loãng 10 - 6, 10 - 7, 10 - 8 mỗi độ

pha loãng cấy trên 3 đĩa thạch TSA (1 - 3% YE), mỗi đĩa nhỏ 0,1ml rồi dàn đều trên

mặt thạch. Sau 18 giờ nuôi cấy ở tủ ấm 370C có 5% CO2 tiến hành đếm số lượng

khuẩn lạc mọc ở các đĩa thạch. Số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn được tính

theo cơng thức sau với đơn vị tính là CFU/ml.

X = a x N x 10

Trong đó: X là số lượng tế bào vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn; a

là số khuẩn lạc trung bình có trong 0,1ml canh khuẩn pha lỗng; N là hệ số pha loãng.

2.4.10. Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập

được trên động vật thí nghiệm



53

Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được lựa chọn trên

chuột bạch theo phương pháp của Sawade (1985) và phương pháp thường qui của

bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia.

Canh trùng vi khuẩn cần kiểm tra được nuôi cấy ở 37 oC trong 24 giờ, trong

q trình ni cấy có lắc để kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn. Tiêm canh trùng

vào xoang phúc mạc của chuột bạch khỏe mạnh, liều tiêm 0,2m/chuột, tiêm 2 chuột

bằng dung dịch BHI để làm đối chứng (mỗi lô tiêm cho 2 chuột). Theo dõi thời

gian chuột chết trong vòng 7 ngày. Những chuột chết được đánh giá qua lâm sàng,

mổ khám quan sát sự biến đổi của nội tạng, lấy máu tim cấy lên mơi trường thạch

máu Columbia (có chất bổ trợ) để phân lập lại vi khuẩn.

2.4.11. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng

vi khuẩn S. suis phân lập được

Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn S. suis phân lập

theo phương pháp của Bauer A.W. (1966) [46] (chi tiết trình bày ở Phụ lục 6).

2.4.12. Xây dựng phác đồ điều trị lợn mắc viêm phổi, viêm khớp

Căn cứ vào kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi

khuẩn S. suis phân lập được, chúng tôi lựa chọn 3 loại thuốc kháng sinh mẫn cảm

cao, đang được phép lưu hành tại Việt Nam. Kết hợp với các loại thuốc điều trị

triệu chứng, trợ sức, trợ lực, xây dựng 3 phác đồ và tiến hành thử nghiệm điều trị.

Cụ thể, một phác đồ điều trị gồm có:

- Thuốc kháng sinh: có độ mẫn cảm cao với vi khuẩn S. suis đã xác định

được xác định bằng kỹ thuật làm kháng sinh đồ, với liều lượng và cách sử dụng

theo khuyến cáo của nhà sản xuất (Chi tiết trình bày ở Phụ lục 9).

Để đánh giá được hiệu quả một cách khách quan, các phác đồ được thực

hiện có sự đồng đều tương đối về các tiêu chí cơ bản sau:

- Số lợn mắc viêm phổi, viêm khớp ở cùng một địa phương được phân ra

ngẫu nhiên làm 3 lô tương ứng với 3 phác đồ điều trị bệnh;

- Số lần và ngày điều trị được dùng đồng đều trong các phác đồ;



54

- Đánh giá hiệu quả của các phác đồ điều trị căn cứ vào sự ổn định dần về

hiện tượng ho, thở, đi lại, tình trạng ăn, uống… sau 10 ngày kể từ khi dùng thuốc.

2.4.13. Phương pháp chế tạo thử nghiệm Autovaccine vô hoạt keo phèn từ các

chủng vi khuẩn S. suis phân lập được

2.4.13.1. Chọn chủng S. suis và kiểm tra giống sản xuất Autovaccine.

Các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm lợn đã

được kiểm tra hình thái trên kính hiển vi, kiểm tra các đặc tính sinh vật, hoá học,

thực hiện các phản ứng PCR để xác định serotype và một số gen mã hóa yếu tố độc

lực. Dựa vào kết quả trên, lựa chọn sơ bộ ra 9 chủng S. suis đại diện cho các

serotype 2, 7, 9 gây bệnh ở lợn và cho các địa bàn nghiên cứu để phục vụ cho các

nghiên cứu tiếp theo. Phương pháp nhân giống và kiểm tra các chủng S. suis trên

theo Quy trình của Bộ mơn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia và TCVN 8400-2:2010

[36].

2.4.13.2. Chế tạo thử nghiệm Autovaccine phòng bệnh

Chế tạo Autovaccine vơ hoạt keo phèn theo quy trình sản xuất Autovaccine

vơ hoạt tồn khuẩn có bổ trợ keo phèn của Bộ mơn Vi trùng, Viện Thú y quốc gia.

* Cấy giống cấp II: giống vi khuẩn được chọn để sản xuất Autovaccine sau

khi đã kiểm tra các tiêu chuẩn cấy vào bình chứa 100 ml BHI (Brain heart

infusion), bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ, trong ni có lắc (300-500 lần/phút), sau

khi ni cấy giống cấp II thì kiểm tra độ thuần khiết.

* Kiểm tra thuần khiết của canh trùng: tiến hành lấy mẫu để kiểm tra thuần

khiết bằng cách: phết tiêu bản, nhuộm Gram, đồng thời nuôi cấy trên các loại môi

trường (nước thịt thường, nước thịt gan yếm khí, thạch máu, thạch McConkey). Sau

khi các canh trùng vi khuẩn của giống cấp II được đếm số vi khuẩn và đạt tiêu

chuẩn thuần khiết. Giống cấp II sau khi đạt tiêu chuẩn thì tiếp tục được sử dụng để

cấy giống cấp III.

* Cấy giống cấp III: Giống cấp II được cấy vào các bình sản xuất lớn chứa

1.000 ml BHI, bồi dưỡng ở 37 oC trong 24h giờ, có lắc (300 - 500 lần/phút). Sau

thời gian nuôi cấy, lấy mẫu kiểm tra thuần khiết như với giống nhỏ, đồng thời tiến

hành đếm số lượng vi khuẩn trong 1 ml canh trùng, bổ sung formalin với tỷ lệ 0,3%



55

(có lắc 300 - 500 lần/phút) để vô hoạt vi khuẩn; ủ ở tủ ấm 37 oC trong 24 giờ và lấy

mẫu kiểm tra vô trùng, nếu đạt tiêu chuẩn vơ trùng thì ra chai nhỏ, đóng nút kín và

gắn sáp bảo vệ. Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất Autovaccine thử nghiệm trình bày

ở Phụ lục 7.

2.4.14. Kiểm tra vơ trùng, an tồn và hiệu lực của Autovaccine thử nghiệm

phòng bệnh liên cầu khuẩn (chi tiết được trình bày ở phụ lục 10).

2.4.15. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của lợn sau tiêm Autovaccine

- Thí nghiệm được tiến hành trên 40 lợn ở 5 tuần tuổi khỏe mạnh, chưa

được tiêm phòng bất kỳ loại vaccine nào có thành phần vi khuẩn S. suis serotype 2,

7 và 9 dùng sản xuất Autovaccine và được lấy máu để kiểm tra khơng có kháng thể

tương ứng với những loại vi khuẩn trên. Thí nghiệm được bố trí như sau:

Lơ thí nghiệm: gồm 35 lợn, được tiêm 2 mũi Autovaccine chế tạo với liều

2,5 ml/con/liều, mũi 2 cách mũi 1 hai tuần (14 ngày).

Lô đối chứng: gồm 5 lợn khơng được tiêm Autovaccine.

- Các lợn thí nghiệm được đánh số và được nuôi chung trong cùng một

chuồng rộng và được xác định trọng lượng trung bình trước và sau khi tiêm

Autovaccine thử nghiệm. Tiến hành theo dõi trạng thái, biểu hiện lâm sàng của các

lợn trước và sau khi tiêm Autovaccine.

- Tiến hành lấy mẫu máu vào các thời điểm: trước khi tiêm Autovaccine và

sau khi tiêm Autovaccine được 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng và 4 tháng. Xác định mức

độ đáp ứng miễn dịch của lợn thí nghiệm bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián

tiếp (Indirect Haemaglunation test – IHA) theo Quy trình đánh giá vaccine của Tổ

chức Thú y thế giới (OIE-2018) [132] hiệu giá ngưng kết phải đạt ≥ 1/16 sau 4

tháng lợn tiêm Autovaccine.

2.4.16. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể ở lợn đã được tiêm

Autovaccine bằng phản ứng IHA

2.4.16.1. Phương pháp lấy máu lợn

Máu được lấy vô trùng từ vịnh tĩnh mạch cổ của lợn bằng bơm tiêm vô

trùng. Sau khi lấy máu, đặt bơm tiêm nghiêng vào tủ ấm 37 oC trong 1 giờ, tiếp theo

được để trong tủ lạnh 4 oC trong 12 giờ, chắt lấy huyết thanh, ly tâm 3.000



56

vòng/phút trong 10 phút. Đánh dấu số mẫu và ngày lấy mẫu. Huyết thanh được bảo

quản ở nhiệt độ - 20oC cho tới khi thực hiện thí nghiệm.

2.4.16.2. Các bước tiến hành phản ứng IHA

Chuẩn bị kháng nguyên: Chủng vi khuẩn S. suis chuẩn được cấy vào thạch

máu và bồi dưỡng ở 37oC trong 18 giờ. Rửa mặt thạch bằng nước sinh lý, đem ly

tâm huyễn dịch vi khuẩn 8.000 vòng/phút, trong 15 phút, chất cặn ở đáy ống được

giữ lại hoặc pha loãng với nước sinh lý sẽ thu được huyễn dịch kháng nguyên.

Huyễn dịch kháng nguyên thu được đun ở 80 oC trong 120 phút và ly tâm 3.000

vòng/phút trong 10 phút. Chắt lấy nước trong, đây chính là kháng nguyên dùng cho phản

ứng IHA.

- Chuẩn bị hồng cầu:

Cho máu cừu vào bình có chứa dung dịch Alsever (dùng chống đông máu)

theo tỷ lệ 1:1. Sau đó rửa hồng cầu bằng dung dịch PBS ba lần rồi pha thành dung

dịch hồng cầu 10% trong PBS.

Formalin hóa hồng cầu bằng cách: cho dung dịch hồng cầu 10% vào bình

tam giác, rồi cho túi cellophane có chứa formalin và PBS (Phosphate-buffered

saline) vào bình. Tùy lượng hồng cầu mà tính lượng formalin thích hợp (tỷ lệ hồng

cầu 10%: formalin: dung dịch PBS là 10: 1: 2), đưa lên máy lắc trong khoảng 20 22 giờ, sau đó ly tâm rửa sạch hồng cầu bẩy lần bằng dung dịch PBS rồi pha thành

dung dịch treo 50% và được bảo quản trong tủ lạnh 40C.

- Hấp thụ hồng cầu - kháng nguyên:

Lấy 0,4 ml hồng cầu 50% đã chuẩn bị cho vào 5 – 7 ml kháng nguyên để

o

37 C trong 2 giờ. Hồng cầu hấp thụ kháng nguyên được rửa 3 lần bằng cách ly tâm

với dung dịch PBS có thêm 0,3 ml formol, bảo quản 4 – 10 oC. Khi dùng hồng cầu

làm phản ứng thì pha bằng dung dịch PBS để có nồng độ 1%.

Huyết thanh cần xác định hiệu giá kháng thể được lấy từ máu lợn đã được

tiêm Autovaccine chế tạo từ chủng S. suis phân lập được và lợn đối chứng. Mỗi

mẫu huyết thanh được pha thành các tỷ lệ: 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64; 1/128.

Làm phản ứng: Phản ứng được thực hiện trên tấm nhựa 96 lỗ đáy tròn.

Đánh giá kết quả: Đọc kết quả lần đầu sau 4 giờ và lần 2 sau 24 giờ.

Phản ứng dương tính: Hồng cầu ngưng kết thành lớp mỏng đều dưới đáy ống.

Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy ống thành cục tròn.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×