Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

Tải bản đầy đủ - 0trang

3.2. Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin bằng HPLC

3.2.1. Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện sắc ký

Dựa vào các tài liệu đã tham khảo [13, 18, 32], và điều kiện của phòng thí nghiệm,

các thơng số sau đây được giữ cố định:

- Cột sắc ký Supelco- C18 250 × 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm.

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút.

- Nhiệt độ: 25ºC.

- Thể tích mẫu: 20 µl.

Các thơng số: bước sóng của detector để ghi sắc ký đồ, thành phần pha động được

khảo sát tối ưu hố.

3.2.1.1. Lựa chọn bước sóng của detector

Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn THC 50 µg/ml với hệ pha động ACN- H2O

(52:48), lấy phổ UV-Vis của pic tR = 9,4 phút cho thấy THC hấp thụ cực đại ở bước

sóng 280 nm (xem hình 3.3). Điều này cũng phù hợp với kết quả đã được công bố trước

đây [17], do vậy chúng tôi lựa chọn 280 nm là bước sóng để ghi sắc ký đồ.



Hình 3.3. Phổ UV-Vis của pic THC thu được khi phân tích dung dịch chuẩn

THC

3.2.1.2. Khảo sát tỷ lệ ACN trong pha động

Hỗn hợp ACN- H2O được chọn làm pha động xuất phát và khảo sát ở các tỷ lệ

khác nhau về thể tích (60:40, 52:48, 40:60), khi tỷ lệ ACN từ 52%, pic THC tách hoàn

toàn, giảm thêm tỷ lệ ACN chỉ kéo dài thời gian phân tích (xem kết quả trong bảng 3.1).

Vì vậy tỷ lệ ACN trong pha động được chọn ở 52%.



21



Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ ACN trong pha động

Tỷ lệ



tR

(phút)



RS



Tf



Sắc ký đồ



THC

60:40



5,9



0,606



--



THC

52:48



9,5



1,632



0,735



THC

40:60



11,1



2,295



1,380



--: khơng tính tồn được, do pic không cân xứng.

3.2.1.3. Khảo sát lựa chọn acid thêm vào pha động

Với hỗn hợp ACN- H2O (52:48) pic THC được tách hoàn toàn trên sắc ký đồ,

nhưng độ cân xứng không đạt yêu cầu. Để giải quyết hiện tượng này, chúng tôi đã bổ

sung acid vào hệ dung môi pha động nhằm cải thiện hình dạng pic: acid formic 0,1%,

acid acetic 2%, acid phosphoric 0,1% [8]. Sắc ký đồ cho thấy pic khơng còn kéo đi.

Độ nhạy và độ hấp thụ của 3 hệ dung môi đều tương đương nhau, tuy nhiên chúng tôi

ưu tiên sử dụng acid formic vì là acid hữu cơ và chỉ cần sử dụng ở nồng độ thấp hơn

acid acetic, acid phosphoric là acid vô cơ, khi sắc ký dễ gây hỏng cột nên hạn chế sử

dụng (xem kết quả trong bảng 3.2). Do vậy, đề tài lựa chọn hệ acid formic 0,1%.

22



Bảng 3.2. Kết quả khảo sát lựa chọn acid thêm vào pha động (A- acid formic

0,1%, B- acid acetic 2%, C- acid phosphoric 0,1%)

Hệ

dung

môi



tR



RS



(phút)



Tf



Sắc ký đồ



THC

Hệ A



9,4



1,873



1,014



THC

Hệ B



9,5



1,820



0,949



THC

Hệ C



9,6



1,794



0,965



3.2.1.4. Điều kiện sắc ký đã tối ưu hoá

- Cột sắc ký Supelco- C18 250 ì 4,6 mm, kớch thc ht nhi 5 àm.

- Pha động: ACN- acid formic 0,1% (52:48) (tt:tt).

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

- Nhiệt độ: 25ºC.

- Thể tích mẫu: 20 µl.



23



Bảng 3.3. Các thông số đánh giá điều kiện sắc ký THC

Thời gian lưu



Độ phân giải



Hệ số kéo



Số đĩa lý



(phút)



RS



đuôi Tf



thuyết N



9,4



1,9



1,0



12238



THC



3.2.2. Nghiên cứu tối ưu hố quy trình xử lý mẫu

Khảo sát thể tích dung mơi

Tiến hành khảo sát ở các thể tích dung mơi chiết: 10ml, 25ml, 50ml, 100ml / 1,0g

mẫu.

Chiết siêu âm 30 phút, sau đó ly tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút, lọc dịch qua

màng 0,22µm, dịch lọc dùng phân tích bằng HPLC.

Kết quả được trình bày trong bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thể tích dung mơi chiết mẫu

Diện tích pic (mAU.s)



Hàm lượng trong mẫu (%)



10ml



12423481



0,37



25ml



5129750



0,39



50ml



2974220



0,46



100ml



1485573



0,46



Nhận xét: Kết quả cho thấy, khi tăng dần thể tích chiết mẫu, thì hàm lượng của

THC định lượng được cũng tăng lên tương ứng. Tuy nhiên khi tăng thể tích từ 50 lên

100 thì hàm lượng tăng khơng đáng kể. Lựa chọn thể tích chiết mẫu là 50 ml.

Đề tài lựa chọn phương pháp xử lý mẫu như sau: Cân chính xác khoảng 1,0g mẫu

thử, đem phân tán vào vừa đủ 50ml methanol trong bình định mức. Đem siêu âm 30

phút, sau đó ly tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch lọc qua màng 0,22 µm dùng

phân tích bằng HPLC.



24



3.2.3. Thẩm định phương pháp

3.2.3.1. Độ phù hợp hệ thống

Để xác định độ thích hợp hệ thống của phương pháp, tiến hành sắc ký 6 lần dung

dịch chuẩn THC 100 µg/ml với điều kiện đã khảo sát, sắc ký đồ được ghi lại trong hình

3.4. Tiến hành ghi lại thời gian lưu và diện tích pic tương ứng trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống

TT



tR (phút)



Diện tích pic (mAU.s)



1



9,427



3091459



2



9,420



3023440



3



9,403



2960549



4



9,384



3018974



5



9,352



2943244



6



9,445



3023440



Trung bình



9,405



3010184



RSD (%)



0,4



1,8



THC



Hình 3.4. Sắc ký đồ đánh giá độ phù hợp hệ thống



25



Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu nhỏ hơn 1% và của diện

tích pic của THC nhỏ hơn 2%, cho thấy điều kiện sắc ký và hệ thống HPLC phù hợp và

đảm bảo độ ổn định của phép phân tích định lượng tetrahydrocurcumin.

3.2.3.2. Độ chọn lọc

Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu placebo thêm chuẩn

với điều kiện đã khảo sát. Sắc ký đồ được ghi lại trong hình 3.5.



Hình 3.5. Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc

Nhận xét: Thời gian lưu của tetrahydrocurcumin trên sắc ký đồ của mẫu thử, mẫu

placebo thêm chuẩn tương ứng với thời gian lưu của THC trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn,

trên sắc ký đồ của mẫu trắng khơng có pic ứng với pic chuẩn của mẫu chuẩn. Bên cạnh

đó, pic của THC tách hồn toàn với các pic của tá dược. Độ tinh khiết của pic THC trong

mẫu thử là 999,1. Như vậy phương pháp trên có độ chọn lọc phù hợp để định lượng

THC trong chế phẩm.

3.2.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Phân tích các mẫu placebo thêm chuẩn với nồng độ giảm dần, tại thời gian lưu

của tetrahydrocurcumin, xác định tỷ lệ S/N đến khi thu được tỷ lệ S/N= 3-4 đối với

LOD, và S/N= 10-20 với LOQ. Mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Sắc

ký đồ xem trong hình 3.6.



26



Hình 3.6. Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ

Kết quả thực nghiệm cho thấy LOD, LOQ của THC lần lượt là 0,1 và 0,4 µg/ml.

3.2.3.4. Độ tuyến tính

Các dung dịch chuẩn có nồng độ THC chính xác trong khoảng 25,0 – 150,0 µg/ml

được phân tích sử dụng các điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Ghi lại sắc ký đồ và thiết lập

đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của THC. Kết quả khảo sát sự

tương quan giữa diện tích pic và nồng độ tetrahydrocurcumin được trình bày trong bảng

3.6.

Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ tuyến tính

TT



Nồng độ (µg/ml)



Diện tích pic (mAU.s)



1



25



725170



2



50



1613562



3



75



2266439



4



100



3091459



27



5



125



4019106



6



150



4703463



Phương trình



y = 31924x – 56779



R



0,999



5000000

y = 31924x - 56779



Diện tích pic (mAU.s)



4500000

4000000

3500000

3000000

2500000

2000000

1500000

1000000

500000

0

0



20



40



60



80



100



120



140



160



Nồng độ (µg/ml)



Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mỗi quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic

Kết quả này cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát có quan hệ tuyến tính

chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic của THC với hệ số tương quan R= 0,999.

3.2.3.5. Độ chính xác

Độ chụm

Độ chụm được đánh giá qua độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Diện tích pic

của các mẫu được ghi nhận và tính tốn lại hàm lượng. Độ lặp lại được thực hiện trong

cùng một ngày với cùng một điều kiện phân tích, và tiến hành với 6 mẫu thử được xử lý

độc lập. Độ chính xác trung gian cũng thực hiện tương tự nhưng thực hiện trong điều

kiện khác ngày. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ chụm



TT



Khối lượng cân



Diện tích pic



(g)



(mAU.s)



28



Hàm lượng

THC trong

mẫu thử (%)



1



1,009



3023440



0,46



2



1,004



2896450



0,44



3



1,003



2911788



0,45



4



1,005



2960549



0,45



5



1,006



2943244



0,45



6



1,014



2896009



0,44



Độ lặp lại



Trung bình



0,45



RSD (%)



1,7



1,011



3043427



0,46



2



1,010



2996540



0,45



3



1,011



2938858



0,45



4



1,009



2948940



0,45



5



1,007



2943244



0,45



6



1,002



2898689



0,44



1



Độ chính

xác trung

gian



Trung bình



0,45



RSD (%)



1,5



Độ lệch chuẩn tương đối của cả 2 phép thử đều nhỏ hơn 2%. Với khoảng nồng

độ đó, u cầu theo AOAC là RSD khơng q 3,7%, do vậy, phép phân tích có độ lặp

lại cùng trong một ngày và giữa các ngày khác nhau đạt yêu cầu để tiến hành phép định

lượng THC trong gel.



29



Độ đúng

Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua độ thu hồi. Chuẩn bị các mẫu

placebo thêm chuẩn ở các nồng độ so với mẫu thử là: 80%, 100%, 120%.

Mẫu placebo thêm chuẩn được chuẩn bị như sau: Cân chính xác 1,0 g mẫu

placebo vào bình định mức. Thêm chuẩn tương ứng với các mức 80%, 100%, 120%

(pha dung dịch chuẩn 1 mg/ml, thêm thể tích dung dịch chuẩn tương ứng vào các mẫu).

Tiến hành định lượng bằng HPLC và mỗi mức thêm chuẩn làm lặp lại 3 lần, lấy

kết quả trung bình và ghi lại trong hình 3.8 và bảng 3.8.



THC

120%

100%

80%



Hình 3.8. Sắc ký đồ đánh giá độ thu hồi của tetrahydrocurcumin

Bảng 3.8. Kết quả đánh giá độ thu hồi

TT



Lượng chuẩn thêm vào

(mg)



Nồng độ (µg/ml)



Độ thu hồi (%)



1



4



77,51



96,88



2



4



76,84



96,05



3



4



80,18



100,22



4



5



99,07



99,07



5



5



95,32



95,32



6



5



98,62



98,62



7



6



120,41



100,34



30



8



6



123,71



103,09



9



6



124,81



104,01



Độ thu hồi của THC với hàm lượng chất trong khoảng 0,1-1% đều nằm trong

khoảng 95-105% (theo AOAC) cho thấy khả năng tìm lại chất chuẩn đáp ứng yêu cầu

độ đúng của phương pháp.

Như vậy, phương pháp định lượng THC bằng HPLC có độ đúng, độ thích hợp hệ

thống, tính chọn lọc, độ lặp lại đạt yêu cầu của AOAC, hoàn tồn có thể áp dụng định

lượng THC trong chế phầm.

3.2.4. Áp dụng phương pháp định lượng đã xây dựng để định lượng

tetrahydrocurcumin trong chế phẩm của 3 lô sản phẩm

Nanoemulgel Tetrahydrocurcumin được lấy mẫu từ 3 lô, mỗi lô 1 mẫu, mỗi mẫu

tiến hành phân tích 3 lần độc lập. Kết quả được ghi trong bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả định lượng THC

Khối lượng mẫu



Diện tích pic



thử (g)



(mAU.s)



1



1,011



3036258



0,46



2



1,002



2942082



0,45



3



1,008



3027079



0,46



4



1,003



3145198



0,48



5



1,015



3116001



0,47



6



1,012



3106623



0,47



7



1,009



3030139



0,46



8



1,002



3075364



0,47



9



1,004



3081616



0,47



TT



31



Hàm lượng (%)



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×