Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Chú thích: TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor): chất ức chế con đường yếu tố mô; TM: thombodulin; PC: protein C; PS: protein S; AT: antithrombin; Fbg: fibrinogen, Fb: fibrin. EPCR (endothelial protein C receptor: thụ thể protein C trên tế bào nội mô).

Chú thích: TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor): chất ức chế con đường yếu tố mô; TM: thombodulin; PC: protein C; PS: protein S; AT: antithrombin; Fbg: fibrinogen, Fb: fibrin. EPCR (endothelial protein C receptor: thụ thể protein C trên tế bào nội mô).

Tải bản đầy đủ - 0trang

15



máu, nó chuyển fibrinogen thành fibrin để hình thành cục máu đơng, kích

thích sự ngưng tập tiểu cầu, và hoạt hóa yếu tố V, VIII, XIII. Thrombin cũng

ức chế đơng máu bằng hoạt hóa protein C.

Đột biến điểm G20210A ở vùng 3’ không phiên mã của gen

prothrombin liên quan tới sự tăng nồng độ prothrombin huyết tương (150 –

200%), thúc đẩy sự hình thành thrombin và làm giảm sự bất hoạt yếu tố Va

bởi APC. Thể đồng hợp của đột biến gen prothrombin gây ra nguy cơ huyết

khối tương đương với thể đồng hợp FVL . Theo phân tích gộp 37 nghiên cứu

bệnh – chứng của Gao H và cộng sự năm 2015 thì thấy mỗi liên quan của

G20210A và RPL (với định nghĩa từ hai lần sẩy thai, thai chết lưu trở lên) là

đáng kể với tỷ lệ gặp ở nhóm RPL cao gần gấp 2 lần so với nhóm chứng, đặc

biệt ở người châu Âu và phụ nữ trên 29 tuổi . Đột biến này làm tăng nguy cơ

RPL và cũng được khuyến cáo nên sàng lọc ở đối tượng RPL .

1.2.4.3. Đột biến gen MTHFR

MTHFR là ký hiệu gen tổng hợp enzyme Methylentetrahydrofolat

reductase (tên thường gọi là NAD(P)H), gen này nằm trên đoạn cuối nhánh ngắn

NST số 1 (1p36.3) gồm 11 exon với độ dài là 2220 cặp base . MTHFR có vai trò

quan trọng trong việc chuyển 5,10 MTHF thành 5-MTHF - chất nhận methyl

đầu tiên trong chu trình chuyển hóa homocystein - methinonin. Enzyme này có

vai trò quan trọng trong chuyển hóa folat; thiếu acid folic hoặc bất thường

MTHFR đã cho thấy sự giảm methyl hóa DNA và những thay đổi bất thường

về sinh hóa và/hoặc kiểu hình ở thí nghiệm trên động vật, ni cấy tế bào và

trên người .



16



Hình 1.3. Chu trình methionin-homocystein

Hiện nay có khoảng 40 loại đột biến gen MTHFR đã được phát hiện.

Trong đó, có hai loại đột biến gặp nhiều hơn cả và được nghiên cứu nhiều

nhất là C677T và A1298C. Đột biến MTHFR C677T xảy ra ở exon 4, dẫn tới

sự thay thế valine thành alanine tại codon 222. Đột biến MTHFR A1298C xảy

ra ở exon 7 dẫn đến thay thế glutamate thành alanine tại codon 429. Cả hai

đột biến này đều làm giảm hoạt tính của enzyme (Bảng 1.3), từ đó làm giảm

tổng hợp 5-MTHF, dẫn tới tăng nồng độ homocystein huyết tương – một yếu

tố nguy cơ của huyết khối mạch máu, liên quan đến các bệnh lý nhau thai,

tiền sản giật và RPL . Đồng hợp đột biến gen MTHFR C677T có nồng độ

homocystein huyết tương cao hơn trong khi thể dị hợp chỉ làm tăng nhẹ

homocystein so với nhóm bình thường, khơng đột biến.



17



Bảng 1.3. Hoạt độ enzyme MTHFR tương ứng với các đột biến gen

A1298C và C677T

Kiểu gen

1298AA

(Bình thường)

1298AC

(Dị hợp)

1298CC



677CC



677CT



677TT



(Bình thường)

100%



(Dị hợp)



(Đồng hợp)



Hoạt động



66%



25%



48%



Khơng phân tích



enzyme

83%



61%

Khơng phân tích Khơng phân tích

(Đồng hợp)

Khi cơ thể thiếu methylenetetrahydrofolate reductase, khả năng hấp thu

acid folic bị ức chế. Acid folic cần thiết cho sự phát triển và sự khỏe mạnh của

thai nhi. Do đó nếu mất chức năng của gen này có thể dẫn đến nhiều biến

chứng trong thai kỳ như bất thường bẩm sinh . Đột biến MTHFR liên quan tới

bệnh homocystein niệu, nguy cơ dị tật ống thần kinh, tật sứt môi, hở hàm ếch ở

thai nhi. Một số nghiên cứu chỉ ra mối liên quan của các đột biến này với việc

làm tăng nguy cơ RPL , và việc xác định đột biến MTHFR C667T có một số ý

nghĩa trong việc phòng RPL ở những đối tượng nguy cơ cao trong khi một số

nghiên cứu khác lại khơng tìm thấy mối liên quan này . Bên cạnh đó, đột biến

MTHFR C677T còn liên quan tới nhiều bệnh lý khác như bệnh chuyển hóa,

rối loạn tâm thần, ung thư và vô sinh nam . Một số nghiên cứu khuyến cáo sử

dụng dạng hoạt động 5-MTHF thay vì dùng acid folic để bổ sung cho những

người mang đột biến gen MTHFR. Hoặc gợi ý bổ sung vitamin B12 cho những

người mang đột biến MTHFR C677T nhằm phòng RPL .

1.2.4.4. PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor – 1/SERPINE1)

Chất ức chế hoạt hóa plasminogen loại 1 (Plasminogen activator



18



inhibitor-1/ PAI-1), là một glycoprotein 55kd được tổng hợp bởi tế bào biểu

mơ, tế bào gan và mẫu tiểu cầu có hạt. PAI-1 có tác dụng như một chất ức chế

hoạt động ly giải fibrin nội sinh do khả năng ức chế chất hoạt hóa

plasminogen mơ (tPA) và chất hoạt hóa plasminogen dạng urokinase (uPA) .

Gen mã hóa cho PAI-1 nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q21.3-q22.1) và chứa 8

intron và 9 exon. Vùng promoter PAI-1 gồm ít nhất 2 alen tạo ra vùng cặp

base 4G hoặc 5G, định khu cách vị trí bắt đầu phiên mã -675bp. Alen 5G bình

thường cho phép gắn cả chất hoạt hóa phiên mã và những yếu tố ức chế sao

chép trong khi alen 4G quá nhỏ để gắn những yếu tố ức chế này, dẫn đến

những người mang dạng đồng hợp 4G/4G có nồng độ PAI-1 trong máu tăng

gấp 5 lần so với người mang alen 5G/5G hoặc 5G/4G . Khi nồng độ PAI-1

tăng sẽ làm giảm quá trình ly giải fibrin dẫn đến tăng nguy cơ huyết khối

mạch máu. PAI-1 cũng là yếu tố nguy cơ quan trọng đối với bệnh mạch vành,

nhồi máu cơ tim và sẩy thai tái diễn.



Hình 1.4. Tác động của PAI-1 và yếu tố XIII lên sự

hình thành và ly giải fibrin

Một số nghiên cứu báo cáo tần số cao hơn đáng kể của PAI-1 4G/5G ở

những bệnh nhân RPL hoặc nguy cơ cao mất thai ở những bệnh nhân PAI-1



19



4G/4G và đưa ra khuyến cáo nên sàng lọc đột biến này ở phụ nữ RPL . Thể

đồng hợp tương đối phổ biến và làm tăng nguy cơ ở mức trung bình đối với

thuyên tắc mạch, sẩy thai, thai chết lưu, thai chậm phát triển trong tử cung,

tiền sản giật và sinh non . Tuy nhiên một số nghiên cứu lại khơng tìm thấy

mối liên quan của đột biến gen này với RPL hoặc chỉ có ý nghĩa đối với

người da trắng .

1.2.4.5. Đột biến Val34Leu yếu tố XIII

Yếu tố đông máu XIII được biết đến là yếu tố ổn định fibrin, đóng vai

trò quan trọng trong sự hình thành rau thai và điều hòa trạng thái đơng – cầm

máu. Yếu tố XIII được cấu tạo bởi 4 chuỗi A2B2, bao gồm 2A và 2B. Phân

đơn vị A có hoạt tính xúc tác với tác dụng kháng sự li giải fibrin thông qua

liên kết chéo ban đầu trong mạng lưới fibrin và gen quy định tổng hợp phân

đơn vị A nằm trên NST 6p24-p25. Phân đơn vị B khơng có hoạt tính xúc tác

và gen quy định tổng hợp phân đơn vị này nằm trên NST 1q31-32.1. Sự thay

thế Guanin bởi Thymin trong exon 2 của gen mã hóa yếu tố XIII (FXIII) dẫn

đến sự thay thế Leucin cho Valine tại amino acid 34. Đột biến yếu tố XIII

Val34Leu làm giảm nồng độ fibrinogen huyết tương và có thể ảnh hưởng tới

cấu trúc mạng lưới fibrin cũng như ức chế q trình ly giải fibrin . Phân tích

gộp kết quả của 9 nghiên cứu khác do Li và cộng sự thực hiện vào tháng

5/2015 ở Trung Quốc cho thấy FXIII Val34Leu có mối quan hệ chặt chẽ với

sẩy thai tái diễn. Alen Val khơng đột biến có thể có tác dụng bảo vệ đối với

RPL . Tỷ lệ phụ nữ RPL mang kiểu gen đột biến FXIII và PAI-1, hoặc kết hợp

cả hai loại này cao hơn so với nhóm phụ nữ khơng bị RPL . Tuy nhiên, cũng

có một số nghiên cứu khơng tìm thấy mối liên quan giữa đột biến này với sẩy

thai, thai chết lưu liên tiếp .

1.2.4.6. Endothelial protein C receptor - EPCR



20



Một con đường đông máu khác liên quan tới thụ thể của protein C ở tế

bào nội mô (endothelial protein C receptor - EPCR) có thể làm thay đổi nguy

cơ huyết khối khi đi kèm với những kiểu gen trên. Một số tổ hợp gen

(haplotype) EPCR làm tăng nồng độ protein C hoạt hóa, góp phần làm thay

đổi sự bình thành của thrombin bằng con đường chống đông của protein C .

Trong đó đột biến 4678G>C (haplotype A1) làm giảm nguy cơ tạo huyết

khối . Tỷ lệ alen 4600A/G (haplotype A3) liên quan với sự tăng nồng độ

EPCR hòa tan (soluble EPCR – sEPCR) huyết tương, tuy nhiên mối liên quan

của nó với nguy cơ huyết khối vẫn còn chưa rõ ràng .

1.2.5. Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết

khối di truyền

Có một số kít thương mại sẵn có trên thị trường giúp phát hiện một số

đột biến gen liên quan tới IT. Các kỹ thuật được áp dụng như PCR – RFLP

(Restriction Fragment Length Polymorphisms), lai phân tử (Hybridization),

giải trình tự gen (Sequencing).

1.2.5.1. Kĩ thuật lai phân tử



Hình 1.5. Minh họa nguyên lý phương pháp lai phân tử

DNA sau khi được tách chiết sẽ được khuếch đại các trình tự đích và

gắn biotin qua phản ứng PCR đa mồi. Sản phẩm PCR sẽ được lai có chọn lọc



21



trên thanh lai. Trên thanh lai có các đoạn dò ologonucleotide (wide type và

đột biến) được cố định trên các đường kẻ song song (parallel lines). Các trình

tự gắn biotin được phát hiện nhờ streptavidine-alkaline phosphatase và cơ

chất màu. Xét nghiệm lai phân tử cho phép phát hiện cả trình tự đột biến và

bình thường (wild type), từ đó xác định kiểu gen đồng hợp hoặc dị hợp của

bệnh nhân.

Bảng 1.4. Một số gen liên quan đến IT được phát hiện với phương pháp

lai bằng bộ kít CVD-T StripAssay (ViennaLab)

STT Tên đột biến gen (ký hiệu)

Đột biến yếu tố V Leiden

1

(FVL)

Đột biến yếu tố V R2

2

(FVR2)

3

Đột biến yếu tố II (F2)

4

Đột biến MTHFR

5

Đột biến MTHFR

Đa hình gen PAI-1

6

(SERPINE1)

Đột biến yếu tố XIIIA

7

(F13A1)

8

Đột biến EPCR (PROCR)

9

Đột biến EPCR



Mơ tả về đột biến gen

Vị trí trên NST

G1691A/

Arg506Gln



(R506Q)

A4070G/

(H1299R)

G20210A

A1298C

C677T



His1299Arg



1q23

11p11

1p36.3



4G/5G



7q21.3-q22.1



Val34Leu



6p25.3-p24.3



A4600G

G4678C



20q11.2



22



1.2.5.2. Kĩ thuật PCR – RFLP (Hiện tượng đa hình về chiều dài của các đoạn

DNA)

Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp này để xác định các đa hình

gen như MTHFR, PAI-1 4G/5G. DNA sau khi được tách chiết sẽ được thực

hiện phản ứng PCR để khuếch đại trình tự đích. Sau đó, sản phẩm PCR này sẽ

được xử lý bằng enzyme cắt giới hạn. Cuối cùng, sản phẩm PCR này sẽ được

phân tích bằng điện di trên thạch agarose. Phương pháp này đơn giản, ít tốn

kém.



23



Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

72 phụ nữ có tiền sử sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp đến Trung tâm

Chẩn đoán trước sinh Bệnh viện Phụ Sản Trung ương và Trung tâm Tư vấn di

truyền – Bệnh viện đại học Y Hà Nội từ 01/9/2015 đến 31/8/2017.

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân:

- Bệnh nhân có tiền sử sẩy thai, thai chết lưu (thai lâm sàng) liên tiếp từ

hai lần trở lên.

- Các lần có thai là thai tự nhiên hoặc sau hỗ trợ sinh sản (IUI, IVF,…)

- Đồng ý tham gia nghiên cứu.

Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân:

- Bệnh nhân đã phát hiện nguyên nhân dẫn tới tình trạng mất thai tái

diễn:

 Bất thường nhiễm sắc thể vợ chồng dẫn tới RPL

 Bất thường tử cung: hở eo tử cung, tử cung đôi, tử cung một sừng,

vách ngăn tử cung, hội chứng Asherman,…

 Bất thường nội tiết tố: suy tuyến yên, suy giáp, tăng prolactin máu,

rối loạn pha hoàng thể.

 Bệnh lý mạn tính: tiểu đường, béo phì

2.2. Địa điểm lấy mẫu và phân tích mẫu

Mẫu máu được thu thập và phân tích tại Trung tâm Chẩn đốn trước

sinh Bệnh viện Phụ Sản Trung ương và Trung tâm Tư vấn di truyền – Bệnh

viện Đại học Y Hà Nội.



24



2.3. Phương tiện nghiên cứu

2.3.1. Dụng cụ

Các máy: Máy luân nhiệt, máy ủ lắc (Thermo-shaker), máy ủ



-



(Incubator/heating block), máy lắc/trộn (Shaker), máy ly tâm với tốc độ

tối đa 14.000 vòng/phút, máy votex, máy điện di, máy đo nồng độ DNA

NanoDrop.

-



Tủ ổn nhiệt (Waterbath), tủ hút chân khơng



-



Buồng UV và máy tính có cài phần mềm chụp ảnh điện di



-



Dụng cụ vơ trùng, pipet, đầu côn các loại, ống eppendorf, găng tay,

giấy thấm. Tủ lạnh âm sâu, tủ lạnh thường



2.3.2. Hóa chất

-



Tách chiết DNA: bộ kit ReliaPrep Blood gDNA Miniprep System



của Promega.

-



Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và lai sản phẩm PCR: bộ kít CVD-T



ViennaLab.

-



Điện di sản phẩm PCR: thạch Agarose 3%



2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Thiết kế nghiên cứu

Tiến cứu, mô tả cắt ngang.

2.4.2. Cỡ mẫu

Cỡ mẫu thuận tiện (toàn thể) trong thời gian nghiên cứu từ 01/9/2015

đến 31/8/2017: 72 bệnh nhân.

2.4.3. Phương pháp tiến hành nghiên cứu

- Chọn bệnh nhân theo tiêu chuẩn và khai thác thông tin

- Thực hiện xét nghiệm

- Thu thập và xử lý số liệu, đưa ra kết quả và bàn luận.



25



Mẫu máu đối tượng nghiên cứu được

chống đông bằng EDTA



Tách chiết DNA

Đo nồng độ, độ tinh sạch



Hồn thiện quy trình

phát hiện đột biến



FV G169A (Leiden),

FV H1299R (R2),

Prothrombin G20210A,

MTHFR C677T và

A1298C

FXIII V34L, PAI-1

4G/5G, EPCR A4600G

và G4678C.



Phản ứng chuỗi

polymerase (PCR)



2. PCR lại

1.Điện di lại



45 phút



Xác định 9 đột biến

bằng kít CVD-T

Stripassay



Điện di sản phẩm PCR



Tiếp tục

chạy 10 phút



Tạm dừng



55 phút



Tiếp tục

chạy 15 phút



65 phút



Tạm dừng



Chụp ảnh băng điện di trong buồng UV



So sánh tìm ra thời



Gắn cơ chất



Rửa sạch sản

phẩm DNA

thừa & dung

dịch lai thừa



gian chạy điện di tối

ưu



Khơng đạt



Dừng



Hiện band và

phân tích kết

quả 9 đột biến



Đạt



Gắn DNA

vào màng lai



Hình 2.1. Phương pháp tiến hành nghiên cứu



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Chú thích: TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor): chất ức chế con đường yếu tố mô; TM: thombodulin; PC: protein C; PS: protein S; AT: antithrombin; Fbg: fibrinogen, Fb: fibrin. EPCR (endothelial protein C receptor: thụ thể protein C trên tế bào nội mô).

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×