Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

3.2. Cấu tạo giải phẫu của loài Adinandra lienii

3.2.1. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang thân cây

Cấu tạo giải phẫu của thân đối xứng toả tròn và có sự chuyển hóa rất cao của

các mơ. Trên lát cắt ngang thân non của lồi A. lienii, có thể phân biệt 9 lớp cơ bản

từ ngồi vào trong, gồm: biểu bì, mơ dày xốp, mô mềm vỏ, mô cứng, libe, gỗ, mô

mềm ruột và lơng che chở (Hình 3.2).

Lớp biểu bì (1): Phủ ngoài thân là một lớp tế bào dày gồm những tế bào hình

trứng xếp xít nhau uốn lượn theo thân tạo thành vòng ngồi cùng, bắt màu xanh,

dày khoảng 10 µm, biểu bì đã hóa bần; có vai trò bảo vệ và che chở cho những

tầng trong của cây.

Mô dày xốp (2): Gồm 3-4 lớp tế bào xếp sít nhau, ít có khoảng gian bào, tế

bào hình tròn hoặc hình trứng. Trong tế bào mơ dày gồm những tế bào sống, vách

dày bắt màu hồng, có chức năng nâng đỡ; có màng sơ cấp dày, khơng hóa gỡ, vẫn là

màng bằng xenluloz; mô dày xốp được coi là mô mềm có màng dày, chun hóa

với chức năng cơ học.

Mơ mềm vỏ (3): Gồm 6-8 lớp tế bào hình trứng, khơng có diệp lục, to hơn

các tế bào mơ dày, xếp thưa để lại nhiều khoảng gian bào, có các bào quan, thể

vùi; chức năng chính là dự trữ và dinh dưỡng.

Mô cứng (4): Là mô nâng đỡ những cơ quan đã trưởng thành không sinh

trưởng tiếp nữa. Mô cứng gồm những tế bào thứ cấp có màng dày hóa gỡ, các tế

bào rất khác nhau về hình dạng, cấu tạo và tính chất. Khi trưởng thành, nội chất

tiêu biến, gồm những tế bào chết. Các tế bào tập trung thành từng đám mô cứng

xếp gần như liên tục tạo thành một vòng, đảm nhiệm chức năng cơ học. Kích

thước của đám mơ cứng khơng đều dày từ 22-50 µm.

Libe (5): Gồm những tế bào hình đa giác, xếp sít nhau, bắt màu hồng, có

màng mỏng; các tế bào libe phân hóa hướng tâm.

Tầng phát sinh (6): Gồm các tế bào sống, có hình chữ nhật hơi dài. Các tế

bào của tầng sinh trụ phân chia theo hướng tiếp tuyến trong cho gỗ thứ cấp và

phân chia theo hướng tiếp tuyến ngồi cho libe thứ cấp.

Gỡ (7): Gồm 5-6 lớp tế bào chết, bắt màu xanh, xếp thành vòng tròn liên tục.

Hệ dẫn của thân gồm gỗ và libe phát triển thành vòng liên tục, phần gỡ phát triển

với nhiều mạch gỡ và mơ mềm gỡ, mạch có hình đa giác xen lẫn với các tế bào mô

31



mềm gỗ bao quanh (dạng mơ mềm quanh mạch). Mạch gỡ có kích thước lớn với

đường kính 12µm.

Mơ mềm ruột (8): Gồm các tế bào tròn cạnh, có kích thước khác nhau chiếm

phần lớn diện tích.

Lơng che chở (9): Có tác dụng ngăn cản sự thoát hơi nước, màu trắng sáng

giúp phản tác một phần nhiệt, ánh sáng mạnh đốt nóng cơ thể. Ngồi ra, lơng che

chở còn có tác dụng chống hạn bằng cách giữ ẩm ở các khoảng trống chân lơng.



Hình 3.2. Giải phẫu cắt ngang thân cây A. lienii

1: Bần; 2: Mơ dày; 3: Mơ mềm vỏ; 4: Vòng mơ cứng; 5: Libe;

6: Tầng phát sinh; 7: Gỗ; 8: Mô mềm ruột; 9: Lông che chở.

3.2.2. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang phiến lá cây

Cấu tạo giải phẫu phiến lá của cây A. lienii gồm các lớp: Biểu bì trên, mơ

giậu, mơ xốp, biểu bì dưới, mơ cứng, libe sơ cấp, gỗ sơ cấp, mô mềm vỏ, mô dày

và lông che chở (Hình 3.3).

Biểu bì trên (1): Là lớp ngồi cùng, được cấu tạo gồm những tế bào hình chữ

nhật nằm ngang, vách thẳng, xếp xít nhau, dày khoảng 9 µm và khơng có lục lạp,

có chức năng bảo vệ; phía ngồi biểu bì có lơng.

Mơ giậu (2): Gồm 2-3 lớp tế bào dài, xếp sít nhau, thẳng vng góc với bề

mặt cơ quan, ít có khoảng gian bào, nằm tiếp giáp ngay dưới biểu bì trên, chứa



32



nhiều lục lạp, kích thước dày khoảng 11-15 µm, chun hóa với chức năng cơ học

và chỉ có ở mặt trên của lá.



Hình 3.3. Giải phẫu cắt ngang phiến lá cây A. lienii

1. Biểu bì trên; 2. Mơ giậu; 3. Mơ xốp; 4. Biểu bì dưới; 5. Libe cứng;

6. Gỡ; 7. Libe mềm ; 8. Mô mềm; 9. Tinh thể canxioxalat; 10. Lông che chở.

Mơ xốp (còn gọi là mơ khuyết) (3): Nằm ngay dưới mơ giậu và trên biểu bì

dưới. Có 4 - 6 lớp tế bào mô mềm gồm các tế bào hình bầu dục, to hơn các tế bào

mơ dày, xếp thưa hơn để lại nhiều khoảng gian bào, gồm các tế bào chứa ít hạt

diệp lục hơn ở mơ giậu, kích thước dày khoảng 10 µm, có chức năng chính là dự

trữ và dinh dưỡng.

Biểu bì dưới (4): Các tế bào biểu bì dưới bé hơn và vách uốn cong hơn, có

kích thước dày khoảng 8µm. Lớp mơ dày gồm 2-3 lớp tế bào sống, có hình đa

giác, vách dày, bằng xenlulose (bắt màu đỏ đậm); các tế bào nằm sát dưới biểu bì

chun hóa với chức năng cơ học, có nhiệm vụ bảo vệ các tế bào bên trong.

Libe cứng (5): Gồm những tế bào có vách dày, xếp liền nhau tạo thành vòng,

đảm nhiệm chức năng cơ học của lá.

Gỗ sơ cấp (6): Gồm 8-9 lớp tế bào chết, bắt màu xanh, có kích thước khác

nhau, nằm phía trong libe tạo nên bó xếp chồng.

Lớp libe mềm (7): Gồm các tế bào sống (bắt màu hồng của thuốc nhuộm

cacmin), có hình đa giác, nhỏ, xếp xít nhau tạo thành một vòng liên tục.

Lớp mơ mềm vỏ (8): Gồm 10-11 lớp tế bào có kích thước khơng đồng đều

chiếm phần lớn diện tích.

33



Tinh thể canxioxalat (9): Tinh thể được hình thành trong tế bào mơ mềm,

tinh thể thường lấp đầy tồn bộ tế bào, thậm chí còn làm biến dạng tế bào. Tinh

thể này được coi như một nhà máy giải độc của lá. (Bắt màu xanh của thuốc

nhuộm xanh metylen).

Lông che chở (10): Là những tế bào mọc dài ra ngồi để tăng cường vai trò

bảo vệ, hoặc để giảm bớt sự thoát hơi nước.

3.3. Đặc điểm của vùng gen matK phân lập từ loài Adinandra lienii

Lá non của loài A. lienii thu tại Lào Cai sử dụng để tách DNA tổng số. Sản

phẩm DNA tổng số được điện di trên gel agarose 0,8% và đo quang phổ để kiểm

tra chất lượng tách. Kết quả kiểm tra cho thấy DNA tổng số thu được đảm bảo

chất lượng cho phản ứng nhân gen. Đoạn gen matK được phân lập bằng phản ứng

PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi đặc hiệu matK-F/matK-R. Sản phẩm PCR

được tiến hành điện di trên gel agarose 0,8%, kết quả điện di xuất hiện 1 băng có

kích thước khoảng 800 bp, ứng với đoạn gen matK theo lý thuyết (Hình 3.4).



Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của loài A. lienii

1: Gen matK, M: DNA marker

Đoạn gen matK được tiến hành tinh sạch và giải trình tự nucleotit trên máy

giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Kết quả giải trình

tự đã xác định được đoạn gen matK phân lập từ loài A. Lienii dài 867 nucleotit

(Hình 3.5). Đoạn gen matK đã phân lập từ loài A. Lienii thu tại Lào Cai được kí

hiệu là LC201904.



34



Sử dụng phần mềm BLAST trong NCBI để phân tích sự tương đồng giữa

trình tự của đoạn gen matK từ lồi A. lienii với trình tự gen matK của một số loài

thuộc chi Adinandra trên GenBank. Kết quả phân tích cho thấy hệ số tương đồng

giữa trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu A. lienii thu tại Lào

Cai so với đoạn gen matK của các loài thuộc chi Adinadra trên GenBank dao động

từ 99,39-100% (Hình 3.6).



Hình 3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gen matK của loài A. lienii thu tại Lào Cai

Tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền giữa lồi A. lienii với một số loài

Adinandra millettii, Adinandra sp. JH-2017, Adinandra nitida và Adinandra

dumosa thuộc chi Adinandra dựa trên trình tự đoạn gen matK. Kết quả so sánh đã

thống kê được trình tự đoạn gen matK thuộc lồi Adinandra lienii và các trình tự

từ các lồi Adinandra millettii (mã số HQ427369.1), loài Adinandra sp. JH-2017

(mã số MF418697.1, MF418698.1), loài Adinandra dumosa (mã số KU853076.1)

và loài Adinandra nitida (mã số KP093833.1) thuộc chi Adinandra có số lượng

nucleotide khác nhau (Bảng 3.1). Cụ thể, số nucleotide của loài A. lienii (trong

nghiên cứu này) là 867, loài Adinandra millettii là 830, loài Adinandra sp. JH2017 là 826-827, loài Adinandra nitida là 756 và loài Adinandra dumosa là 754

35



nucleotide. Kết quả này cho thấy, đoạn gen matK từ mỡi lồi thuộc chi Adinandra

có kích thước khác nhau và đặc trưng cho từng lồi.



Hình 3.6. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự đoạn gen matK của lồi

A. lienii so với trình tự đoạn gen matK trên GenBank bằng BLAST trong NCBI

Bảng 3.1. Các trình tự nucleotide của đoạn gen matK sử dụng trong phân tích

TT

Lồi

Mã số trên

Tác Giả

Năm

Kích

GanBank

thước

(bp)

1



Adinandra sp. JH- MF418698.1

2017



Heckenhauer và cộng

sự



2017



827



2



Adinandra sp. JH- MF418697.1

2017



Hecken và cộng sự



2017



826



3



Adinandra millettii



HQ427369.1



Pei và cộng sự



2016



830



4



Adinandra nitida



KP093833.1



Liu và cộng sự



2015



756



5



Adinandra dumosa



KU853076.1



Srivathsan và cộng sự



2016



754



36



Hình 3.7. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ loài A. lienii thu tại

Lào Cai, Việt Nam và trình tự đoạn gen matK cơng bố trên GenBank

37



Trình tự nucleotide của đoạn gen matK của loài A. lienii được so sánh với các

lồi trong bảng 3.1 tại vị trí nucleotide thứ 113 đến 828 cho thấy trình tự các

nucleotide của 6 loài tương đối giống nhau, ngoại trừ một số điểm khác biệt tại

các vị trí nucleotide số 192, 193 (T thay bằng C), 663 (A thay bằng C) và 778 (G

thay bằng A). Các trình tự nucleotide còn lại liên quan tới sự sai khác số lượng

nucleotide (Hình 3.7).

Trình tự nucleotide của đoạn gen matK từ 6 loài được sử dụng phần mềm

MegAlign để xác định hệ số tương đồng, hệ số phân ly và cây phát sinh chủng

loại. Kết quả bảng 3.2 cho thấy hệ số tương đồng và hệ số phân ly trình tự của

đoạn gen matK từ loài A. lienii với các loài thuộc chi Adinandra dao động từ 95,9100% và hệ số phân ly từ 0-2,2%.

Bảng 3.2. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly trình tự các nucleotide của đoạn gen

matK từ lồi Adinandra lienii và các loài thuộc chi Adinandra



Khi nghiên cứu về cây phát sinh chủng loại, trình tự nucleotide của đoạn gen

matK từ 6 loài được xếp vào các nhánh khác nhau. Loài Adinandra lienii

(LC201904.1) nằm một nhánh, gần với loài Adinandra nitida (KP093833.1). Kết

quả cho thấy, loài Adinandra lienii trong nghiên cứu khơng trùng lặp với các lồi

đã cơng bố (Hình 3.8). Như vậy, thơng qua hệ số tương đồng, hệ số phân ly và cây

phát sinh chủng loại của đoạn gen matK phân lập từ loài Adinandra lienii thu tại

Lào Cai (Việt Nam) trong nghiên cứu này đã bước đầu khẳng định được chính xác

lồi nghiên cứu và là công bố đầu tiên bổ sung dữ liệu về sinh học phân tử của lồi

Adinandra lienii thuộc chi Adinandra.



38



Hình 3.8. Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự các nucleotide của đoạn gen matK

3.4. Khảo sát các hợp chất có trong các phân đoạn dịch chiết của cây

Adinandra lienii

Lồi A. lienii sau khi thu hái về được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khơ

ở nhiệt độ 50ºC đến khối lượng khơng đổi, sau đó đem nghiền nhỏ. Cao chiết phân

đoạn của cây A.lienii được điều chế theo sơ đồ hình 2.1 ở phần phương pháp.

3.4.1. Định tính polyphenol

Dịch chiết của lồi A. lienii được định tính polyphenol bằng thuốc thử với

muối sắt (III), nhận thấy dung dịch trong ống nghiệm B chuyển sang màu xanh lục

(Hình 3.9a). Trong khi định tính bằng dung dịch H 2SO4 đặc, dung dịch trong ống

nghiệm B chuyển sang màu vàng đậm (Hình 3.9b). Như vậy trong dịch chiết của

lồi A. lienii có chứa các nhóm chất polyphenol.

a



b



Hình 3.9. Phản ứng với muối sắt (III) (a) và với dung dịch H 2SO4 đặc (b)

A. Dung dịch ban đầu; B. Dung dịch sau phản ứng



39



3.4.2. Định tính các flavonoid

Dịch chiết của lồi A. lienii được định tính flavonoid bằng dung dịch axit

HCl đặc và bột Mg kim loại. Kết quả hình 3.10 nhận thấy, dung dịch trong ống

nghiệm B chuyển từ màu vàng sang màu đỏ đậm. Như vậy, trong dịch chiết của

loài A. lienii khơng chứa thành phần flavonoid.



Hình 3.10. Định tính các flavonoid

A. Dung dịch ban đầu; B. Dung dịch sau phản ứng

3.4.3. Định tính các coumarin

Cao chiết của lồi A. lienii được định tính các coumarin bằng dung dịch

NaOH 10%. Kết quả nhận thấy, khi cho 0,5ml NaOH 10% vào ống nghiệm B,

đem đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thủy, sau khi làm nguội và cho thêm 4ml

nước cất vào cả ống thì dung dịch ống B trở lên trong hơn (Hình 3.11a). Sau khi

cho vài giọt HCl đặc vào cả 2 ống nghiệm thì ống B mất màu vàng đục (Hình

3.11b). Như vậy, trong dịch chiết của lồi A. lienii chứa thành phần coumarin.

Từ kết quả định tính cho thấy, trong dịch chiết của lồi A. lienii có chứa

nhiều nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học như các nhóm chất polyphenol

và coumarin. Các nhóm hợp chất này có ý nghĩa trong việc ứng dụng làm thuốc

chữa bệnh và đây là cơ sở để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.



40



a

b

Hình 3.11. Định tính coumarin phản ứng với NaOH (a) và HCl đặc (b)

A. Dung dịch ban đầu; B. Dung dịch sau phản ứng

3.4.4. Phân tích thành phần các hợp chất trong cao chiết của loài A.

lienii

Cao chiết ethanol và cao chiết ethyl acetate từ cây A. lienii được chạy TLC

sử dụng các hệ dung môi khác nhau, gồm hệ n-hexan : acetone tỉ lệ 1:1;

dichlomethane : n-hexan tỉ lệ 3:1 và hiện mầu bằng H 2SO4 đặc để xác định số

lượng các chất có trong cao chiết.



A

B

Hình 3.12. Sắc kí đồ cao chiết ethanol



A

B

Hình 3.13. Sắc kí đồ cao chiết ethanol



(A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung



(A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung



môi n-hexan : acetone tỉ lệ 1:1



môi dichloromethane : n-hexan tỉ lệ 3:1



41



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×