Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
- Độ nhạy của HMMD phụ thuộc vào bộ kháng thể: Trừ khi các kháng thể mới trở nên có sẵn, HMMD sẽ không thể phát hiện những gen khác. Ngược lại, xét nghiệm MSI có khả năng dự đoán các bất thường bệnh học ở bất kỳ gen MMR nào (mặc dù đã có những ngoại lệ, n

- Độ nhạy của HMMD phụ thuộc vào bộ kháng thể: Trừ khi các kháng thể mới trở nên có sẵn, HMMD sẽ không thể phát hiện những gen khác. Ngược lại, xét nghiệm MSI có khả năng dự đoán các bất thường bệnh học ở bất kỳ gen MMR nào (mặc dù đã có những ngoại lệ, n

Tải bản đầy đủ - 0trang

14



xét nghiệm MSI trên mẫu sinh thiết nhỏ sẽ tương đương hoặc thậm chí khơng

đáng tin cậy hơn. Ngồi ra, HMMD còn khả năng xác định gen cụ thể và do

đó nó có thể được hiểu như là một "xét nghiệm di truyền". Mặt khác, khả

năng của HMMD phụ thuộc vào bộ kháng thể, và nó có thể bỏ sót các trường

hợp trong đó các khiếm khuyết cơ bản nằm trong các gen không được khảo

sát khác .

1.4.3. Nguyên lý cơ bản của hố mơ miễn dịch

HMMD là một phương pháp nhuộm đặc biệt, sử dụng các kháng thể để

xác định kháng nguyên trong mô, là một phương pháp hỗ trợ rất quan trọng

cho chẩn đốn mơ học, tuỳ thuộc vào các chẩn đoán phân biệt và các dấu ấn

được dùng mà HMMD có thể giúp các nhà GPB đưa ra các chẩn đốn quyết

định. Mục đích chính của HMMD là xác định chính xác hơn bản chất của tế

bào, các đại phân tử có mặt trong tổ chức so với kỹ thuật nhuộm hố mơ.

- Dựa trên ngun tắc một số ung thư có những protein đánh dấu có thể

được sử dụng để định typ mơ học, vì vậy đã có một số phương pháp phát hiện

các kháng nguyên này trong các lát cắt mô bằng các kỹ thuật đặc hiệu.

- Kỹ thuật HMMD trên các lát cắt lạnh của bệnh phẩm bảo tồn được

kháng nguyên song ít nhạy cảm và khó áp dụng rộng rãi cho các cơ sở GPB.

- Phương pháp miễn dịch men như PAP (Peroxidase Anti- Peroxidase),

ABC (Biotin- Avidin Complex) áp dụng trên các lát cắt từ bệnh phẩm chuyển

đúc trong paraffin là phương pháp phổ biến. Phương pháp này vừa nhạy vừa dễ

thực hiện, dễ phát hiện bằng KHVQH, đồng thời được sử dụng cho cả các

nghiên cứu hồi cứu. Tuy nhiên, nó đòi hỏi phương pháp cố định không làm phá

huỷ kháng nguyên. Người ta khuyên trong nhuộm HMMD nên có cả vùng mơ

bình thường coi như một chứng âm tính hoặc dương tính với kháng nguyên.



15



Kỹ thuật HMMD là dựa trên phản ứng miễn dịch của sự kết hợp giữa

kháng nguyên và kháng thể và các hoá chất để làm hiện rõ phức hợp kháng

nguyên- kháng thể này dưới KHVQH. Các kháng nguyên có thể hiện diện ở

trong bào tương, màng tế bào, hoặc nhân.

- Kháng thể chủ yếu là IgG, kết hợp trực tiếp với kháng nguyên gọi là

kháng thể thứ nhất gồm hai loại:

+ Kháng thể đa dòng chứa nhiều kháng thể khác nhau và chúng phản

ứng với nhiều quyết định kháng nguyên (epitop).

+ Kháng thể đơn dòng chỉ chứa một loại quyết định kháng nguyên,

nhược điểm là có phản ứng chéo với các quyết định kháng nguyên tương tự

trên một kháng ngun khơng liên quan.

- Vì phức hợp kháng nguyên- kháng thể không thể thấy được dưới

KHVQH nên cần một hệ thống để hiển thị vị trí có phản ứng kháng nguyênkháng thể, gồm 2 phần:

+ Kháng thể thứ hai là cầu nối kháng thể thứ nhất với hệ thống phóng

đại dấu hiệu nhận biết là kháng thể kháng kháng thể thứ nhất, kháng thể thứ

hai được gắn với Biotin trong phương pháp ABC.

+ Hệ thống phóng đại dấu hiệu nhận biết gồm một men, cơ chất và

chất màu trong phương pháp ABC men được gắn với kháng thể bằng một

phần cầu nối hoá học (Avidin và Biotin). Với một chất nền thích hợp với men

và chất màu được gắn lên để cho phép xác định được sự hiện diện của kháng

ngun trong mơ dưới KHVQH. Có nhiều phương pháp để hiển thị phản ứng

kháng nguyên- kháng thể, song phương pháp ABC ở trên được sử dụng nhiều

vì có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Vì Avidin có ái lực mạnh với Biotin và men

peroxidase, làm cầu nối cho men gắn vào Biotin (trên kháng thể thứ hai). Một

phân tử Avidin có 4 vị trí gắn men peroxidase nên hệ thống nhận biết được

phóng đại lên gấp 4 lần.



16



4



5



1- Kháng nguyên



6



2- Kháng thể thứ nhất

3



3- Kháng thể thứ hai

4- Men peroxidase

5- Avidine

6- Biotine



2



1



Sơ đồ 1.1. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật HMMD

1.5. Vai trò dự báo sự đáp ứng với hóa trị của MSI

Gần đây, hóa trị dựa vào fluorouracil có lợi đối với các khối u ĐTT giai

đoạn II hoặc III có MSI-L hoặc MSS nhưng khơng có lợi ở u ĐTT giai đoạn

II hoặc III với MSI-H . Các xét nghiệm MSI có thể được sử dụng để dự đốn

sự đáp ứng với hóa trị bổ trợ, mặc dù thực tế, vấn đề này còn gây tranh cãi.

Gen MMR đã được xác định trong vi khuẩn; bất hoạt đột biến tạo ra một kiểu

hình đột biến và cho phép dung nạp các tác nhân gây tổn hại DNA. Một kiểu

hình tương tự cũng được tìm thấy trong các dòng tế bào động vật có vú. Sự

sửa đổi ổn định hoạt động MMR trong dòng tế bào đã khôi phục các đáp ứng

độc tế bào với các tác nhân alkyl hóa, 6-thio-guanine, 5-FU, hợp chất bạch

kim và tác nhân khác. Điều này cho thấy rằng khối u có MSI có thể kháng lại

một số phác đồ hóa trị. Nhìn chung, thời gian sống thêm là tốt hơn đáng kể ở

nhóm MSI, bất kể sự điều trị.

Fallik et al, các kết luận phác đồ hóa trị có chất ức chế topoisomerase-I,

irinotecan làm tăng thời gian sống thêm ở những bệnh nhân với ung thư ĐTT

với MSI, kết quả này đã được Bertagnolli et al ủng hộ. Có thể kết hợp các

loại thuốc khơng có độc tế bào quá mức sẽ tốt nhất cho những bệnh nhân ung



17



thư ĐTT với MSI. Khơng có bằng chứng về hiệu quả của hóa trị bổ trợ truyền

thống bằng 5 FU ở những bệnh nhân với ung thư ĐTT với MSI, nhưng có thể

có phác đồ điều trị sẽ có lợi cho những bệnh nhân này. Bệnh nhân có ung thư

ĐTT với MSI cần được đưa vào thử nghiệm lâm sàng cho đến khi xác định

được phác đồ điều trị thích hợp .

1.6. Vai trò dự báo sự tiên lượng của MSI

Bệnh nhân bị ung thư ĐTT với MSI có thời gian sống lâu hơn những

bệnh nhân bị u khơng có MSI. Một nghiên cứu 175 bệnh nhân bị hội chứng

Lynch (120 người trong số họ có hội chứng Lynch - loại MLH1), được so

sánh với hơn 14.000 bệnh nhân ung thư ĐTT dựa vào quần thể, cho thấy thời

gian sống cộng dồn 5 năm đối với những bệnh nhân bị hội chứng Lynch là

65%, so với 44% bệnh nhân ung thư ĐTT đơn lẻ, trên 65 tuổi. Bệnh nhân có

hội chứng Lynch mắc bệnh ở giai đoạn thấp hơn so với bệnh nhân với các loại

ung thư ĐTT khác, và ít biểu hiện di căn. Gryfe et al báo cáo rằng 17% bệnh

nhân ung thư ĐTT có MSI trẻ hơn 50 tuổi; tỷ suất chênh đối với bệnh nhân có

khối u liên quan MSI là 0,42, so với bệnh nhân trong cùng nhóm với khối u

khơng MSI. Bệnh nhân có khối u với MSI có tỷ lệ tử vong thấp hơn, gồm cả

các bệnh nhân bị ung thư giai đoạn IV .

Khối u với MSI có số lượng lớn tế bào lympho xâm nhập khối u được

kích hoạt và gây độc tế bào; phản ứng lympho bào có liên quan một cách độc

lập với thời gian sống thêm kéo dài hơn. Nghiên cứu báo cáo rằng các khối u

ĐTT có xâm nhập lympho bào có liên quan với thời gian sống thêm lâu hơn;

trên thực tế, xâm nhập lympho có thể là một yếu tố tiên lượng tốt hơn so với

giai đoạn GPB. Kết quả HMMD MSH2 và MLH1 bất thường dự đoán độc lập

kết quả tốt hơn ở những bệnh nhân với khối u ĐTT giai đoạn II-T3. Do đó,

phát hiện của MSI ở một bệnh nhân với ung thư ĐTT là một yếu tố tiên lượng

tốt, đặc biệt là ở những bệnh nhân trẻ tuổi .



18



Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu tại Khoa GPB-TB, Bệnh viện

K từ 06/2017 đến tháng 12/2018.

2.2. Đối tượng nghiên cứu

Tiêu chuẩn lựa chọn: các trường hợp được chọn đưa vào nghiên cứu

phải có các tiêu chuẩn sau:

- Bệnh nhân được chẩn đốn ung thư biểu mơ đại trực tràng tại Bệnh

viện K, có chẩn đốn mơ bệnh học là ung thư biểu mơ ĐTT ngun phát.

- Có đầy đủ thông tin lâm sàng: tuổi, giới, nghề nghiệp, triệu chứng, tiền

sử, các xét nghiệm cận lâm sàng,...

- Có mẫu mô đủ và đảm bảo chất lượng để làm xét nghiệm hóa mơ miễn

dịch cho 4 dấu ấn MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 và xét nghiệm sinh học phân tử.

Tiêu chuẩn loại trừ: các trường hợp sau sẽ bị loại khỏi nghiên cứu:

- Bệnh nhân được chẩn đoán là u di căn hoặc tái phát

- Hồ sơ thông tin không đủ

- Bệnh phẩm sinh thiết quá nhỏ, không đủ cho các xét nghiệm hóa mơ

miễn dịch và xét nghiệm sinh học phân tử.

2.3. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp mô tả cắt ngang.

2.4. Cỡ mẫu và chọn mẫu:

Trong thời gian từ 6/2017 đến 12/2018 có 71 bệnh nhân ung thư đại trực

tràng được mổ tại bệnh viện K cơ sở Quán sứ có đủ tiêu chuẩn nghiên cứu sẽ

được lựa chọn vào nghiên cứu.



19



2.5. Biến số và các chỉ số nghiên cứu

* Mục tiêu 1:

- Đánh giá kết quả nhuộm HMMD: MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2 để

xác định MSI và thể ung thư theo tiêu chuẩn dưới đây và tính tỷ lệ của tình

trạng MSI và các thể lâm sàng:

Bảng 2.1. Tiêu chuẩn HMMD xác định MSI và thể lâm sàng

MLH1



PMS2



MSH2



MSH6



Kiểu hình

MSI



Giải thích về

lâm sàng



+



+



+



+



MSS/MSI-L



UTĐTT đơn

lẻ (rất ít khả

năng là LS)



-



-



+



+



MSI-H



UTĐTT đơn

lẻ hoặc LS



+



+



-



-



MSI-H



LS



+



+



+



-



MSI-H



LS



+



-



+



+



MSI-H



LS



* Mục tiêu 2: Nhận xét mối liên quan giữa MSI, thể lâm sàng với:

- Tuổi bệnh nhân

- Vị trí u theo giải phẫu. U gần: đại tràng phải, đại tràng ngang; u xa: đại

tràng xuống, sigma, trực tràng.

- Phản ứng đệm lympho dạng Crohn được ghi nhận khi có ít nhất 4 nốt

lympho trong một vi trường có độ phóng đại thấp (×4) vượt ra khỏi bờ xa của

khối u và thường nằm trong lớp hạ thanh mạc hoặc mỡ mạc treo .

- Sự xâm nhập lympho u: Các tế bào lympho xâm nhập vào tế bào u khi

có ít nhất 5 tế bào lympho ở ít nhất một vi trường có độ phóng đại cao (×40)

và ít nhất 10 vi trường có độ phóng đại cao .

- Typ mơ bệnh học: tế bào nhẫn hoặc chế nhày, thể tủy



20



- Giai đoạn TMN: theo AJCC lần thứ 8

- Tình trạng hạch

2.6. Cơng cụ và kỹ thuật thu thập thông tin

2.6.1. Công cụ thu thập thông tin

Sử dụng phiếu nghiên cứu mẫu được thiết kế theo các chỉ số nghiên cứu

để thu thập thông tin từ bệnh án, phỏng vấn bệnh nhân, kết quả các xét

nghiệm từ khoa GPB-TB.

2.6.2. Kỹ thuật thu thập thông tin

2.6.2.1. Nghiên cứu về mô bệnh học

* Kỹ thuật mơ học

- Đánh giá khối u và kích thước u: Các bệnh phẩm ung thư ĐTT được

phẫu tích đo kích thước, nhận xét về ranh giới, mật độ và màu sắc. Mỗi khối u

lấy từ 3-5 mảnh toàn bộ bề dày của thành ĐTT, dày 2-3mm.

- Đánh giá tình trạng hạch: Hạch các nhóm được phẫu tính, đếm số

lượng, đo kích thước.

Một điều đặc biệt trong nghiên cứu này là tất cả các mẫu mô được lấy

với thời gian thiếu máu ngắn nhất (<30 phút sau khi cắt khỏi cơ thể) và được

cố định trong formol trung tính. Như vậy chất lượng mẫu mô được đảm bảo

chất lượng một cách tối đa nhất Sau đó các bệnh phẩm được chuyển, đúc

trong paraffin, cắt và nhuộm tiêu bản theo phương pháp Hematoxylin-Eosin

(H-E) thường qui.

* Phân loại MBH và phân độ MBH

Các tiêu bản nhuộm H-E được phân typ MBH theo bảng phân loại của

WHO-2010.

2.6.2.2. Cách đánh giá giai đoạn bệnh

Chúng tôi áp dụng cách xếp giai đoạn sau mổ của AJCC - năm 2017.



21



2.6.2.3. Nghiên cứu hóa mơ miễn dịch

* Kỹ thuật hóa mơ miễn dịch

- Phương pháp nhuộm bằng máy tự động của Ventana:

+ Nhuộm hố mơ miễn dịch theo phương pháp phức hợp Avidin Biotin

tiêu chuẩn (Standard Avidin Biotin Complex Method).

+ Kỹ thuật hố mơ miễn dịch được thực hiện trên mô đúc khối nến với

các dấu ấn miễn dịch dự định sau: MLH1, MSH2, MSH6, PMS2

+ Quy trình nhuộm tiêu bản hố mơ miễn dịch theo phương pháp phức

hợp Avidin Biotin tiêu chuẩn gồm có các bước như sau:

1. Mảnh cắt nến sau khi tẩy paraffin được nhúng vào nước cất

2. Bộc lộ kháng nguyên: Khử peroxidase nội sinh bằng dung dịch H 2O2

3% x 5 phút.

3. Rửa tiêu bản bằng dung dịch Tris-Buffer-Saline (TBS) pH 7,6 x 5 phút.

4. Khử các protein không đặc hiệu bằng Bovine-Serum-Albumine x 5 phút.

5. Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 2 lần x 5 phút, không để khô tiêu bản.

6. Phủ kháng thể kháng nguyên thứ nhất x 60 phút.

7. Rửa TBS 2 lần x 5 phút.

8. Phủ kháng thể thứ hai x 30 phút.

9. Rửa TBS 2 lần x 5 phút.

10.Phủ phức hợp Avidin-Biotin (ABC) x 30 phút.

11. Rửa TBS 2 lần x 5 phút.

12.Phủ dung dịch Diamino Benzidine (DAB) x 10 phút.

13.Rửa nước chảy x 5 phút.

14.Nhuộm Hematoxyline 5 giây.

15.Khử nước, làm sạch tiêu bản, gắn lá kính rồi đọc kết quả trên kính hiển

vi quang học.

* Kháng thể sử dụng, kiểu bắt màu và đánh giá kết quả HMMD

Sử dụng kháng thể chuột pha sẵn của Roche, kháng protein MLH1,

MSH2, MSH6, PMS2.



22



Kiểu bắt màu nhuộm khi dương tính: nhuộm nhân

Dương tính khi bất kỳ nhân tế bào u nào bắt màu

* Kiểm chứng dương và kiểm chứng âm:

- Kiểm chứng dương: là nhân tế bào lympho hoặc nhân tế bào biểu mơ

tuyến bắt màu là dương tính làm chứng dương.

- Kiểm chứng âm: Không phủ kháng thể thứ nhất vào tiêu bản đối với tất

cả các trường hợp nhuộm tiêu bản chứng âm.

* Đánh giá tình trạng MSI và thể lâm sàng theo bảng 2.1 ở trên.

* Các bước nghiên cứu:

Bước 1: Chọn đối tượng nghiên cứu dựa trên tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân.

Bước 2: Thu thập các thông tin lâm sàng từ bệnh án hoặc hỏi bệnh nhân:

Tuổi, giới, tiền sử gia đình, triệu chứng, chẩn đốn hình ảnh và nội soi.

Bước 3: Các bệnh phẩm sinh thiết hoặc sau phẫu thuật được phẫu tích u,

đo kích thước u và cắt các mảnh, cố định trong formol trung tính và chuyển

đúc trong paraffin. Tiêu bản sau khi được cắt nhuộm HE và được đọc qua

kính hiển vi, phân typ mô bệnh học, đánh giá các đặc điểm mô bệnh học, di

căn hạch hoặc xâm lấn xung quanh.

Bước 4: Xác định mẫu bệnh phẩm đủ điều kiện làm xét nghiệm hóa mơ

miễn dịch, nhuộm hóa mơ miễn dịch tại trung tâm với 4 dấu ấn MLH1,

MSH2, MSH6, PMS2. Đánh giá kết quả và ghi nhận vào mẫu nghiên cứu

(theo bảng trên).

Bước 5: Các trường hợp sau khi nhuộm HMMD cần làm thêm xét

nghiệm gen sẽ sử dụng phương pháp Realtime PCR để đánh giá tình trạng đột

biến gen MLH1. Ghi nhận kết quả.

Bước 6: Kết hợp tuổi, tiền sử gia đình, MSI đưa ra các khuyến cáo sàng

lọc hội chứng Lynch theo tiêu chuẩn Bethesda năm 2004.

Bước 7: Xử lí, phân tích số liệu và viết báo cáo



23



2.7. Xử lý và phân tích số liệu

- Các trường hợp nghiên cứu được ghi nhận đầy đủ thông tin và mã

hóa dữ liệu.

- Lưu trữ dữ liệu bằng chương trình Excel 2003.

- Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 10.

- Sử dụng phép kiểm t (2 phía), 2 với độ tin cậy 95%.

2.8. Khống chế sai số

- Có thể gặp do sai số thơng tin trong q trình nghiên cứu.

- Sai số do bệnh phẩm khơng đảm bảo tiêu chuẩn.

- Một số biện pháp khắc phục: Thiết kế mẫu nghiên cứu rõ ràng, thống

nhất. Bệnh phẩm được xử lí đúng quy trình, do người nghiên cứu tiến hành.

2.9. Đạo đức trong nghiên cứu

- Bệnh phẩm nghiên cứu là các mẫu mô ung thư vú của bệnh nhân được

làm xét nghiệm tại khoa GPB-TB, Bệnh viện K.

- Tuyệt đối giữ bí mật về những thơng tin của bệnh nhân.

- Chúng tôi cam đoan, nghiên cứu này chỉ nhằm mục đích duy nhất là

nâng cao khả năng chẩn đốn, điều trị và tiên lượng bệnh để phục vụ người

bệnh và cộng đồng, khơng nhằm mục đích nào khác và không gây bất kỳ tổn

hại nào cho người bệnh.

- Không có sự phân biệt giữa bệnh nhân nghiên cứu và bệnh nhân khơng

nghiên cứu.



24



Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Tình trạng MSI và thể lâm sàng

3.1.1. Tình trạng MSI

Bảng 3.1. Tỷ lệ bộc lộ các dấu ấn

Tổng số



Âm tính



Dương tính



N



%



N



%



MLH1



71



10



14,1



61



85,9



MSH2



71



3



4,2



68



95,8



MSH6



71



6



8,5



65



91,5



PMS2



71



12



16,9



5



83,1



Nhận xét:

Trong 71 u ĐTT, PMS2 có tỷ lệ âm tính cao nhất (16,9%), tiếp đến là

MLH1 (14,1%), sau đó là MSH6: 8,5% và thấp nhất là MSH2: 4,2%.

Bảng 3.2. Tỷ lệ không bộc lộ của các cặp dấu ấn



N



%



MLH1 – PMS2



10/71



14,1



MSH2 – MSH6



3/71



4,2



Nhận xét:

Sự không bộc lộ đồng thời cặp MLH1 và PMS2 chiếm tỷ lệ cao nhất là

14,1%. Cặp MSH2 và MSH6 chiếm tỷ lệ thấp hơn là 4,2%.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

- Độ nhạy của HMMD phụ thuộc vào bộ kháng thể: Trừ khi các kháng thể mới trở nên có sẵn, HMMD sẽ không thể phát hiện những gen khác. Ngược lại, xét nghiệm MSI có khả năng dự đoán các bất thường bệnh học ở bất kỳ gen MMR nào (mặc dù đã có những ngoại lệ, n

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×