Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

- Dung mơi, hố chất tinh khiết phân tích: Methanol (Trung Quốc, PA).

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ

- Cân kĩ thuật Satorius TE3102s (Đức)

- Cân phân tích Satorius BP121S (Đức)

- Cân phân tích 5 số Mettler Toledo MS105 (Mỹ)

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản)

- MRC Digital Viscometer

- Máy phân tích kích thước hạt SZ 100 (Horiba)

- Máy đo pH MILLWAUKEE

- Bể siêu âm

- Bộ lọc dung mơi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 µm

- Bình định mức, pipet, vial, eppendof, màng lọc 0,22 µm

- Micropipet và các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm

2.2. Nội dung nghiên cứu:

2.2.1. Định tính

2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin trong chế phẩm

2.2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký

Khảo sát thành phần và tỷ lệ dung môi pha động.

2.2.2.2. Tối ưu hố quy trình xử lý mẫu

Thể tích dung mơi chiết mẫu.

2.2.2.3. Thẩm định phương pháp đã xây dựng

- Độ phù hợp của hệ thống

- Tính chọn lọc của phương pháp

- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Độ tuyến tính và khoảng nồng độ

- Độ chính xác (độ chụm và độ đúng)

2.2.3. Các tiêu chí khác

- Cảm quan: đánh giá dựa trên thể chất và màu sắc bằng quan sát mắt thường.

13



- pH: được đo bằng máy đo pH.

- Độ đồng nhất: đánh giá theo phụ lục 1.12-DĐVN V [1].

- Độ nhớt: được đánh giá bằng máy đo độ nhớt dạng xoay.

- Kích thước giọt và phân bố kích thước giọt: đánh giá bằng phương pháp tán xạ ánh

sáng động sử dụng thiết bị Nano partica SZ-100 series (Horiba).

2.2.4. Áp dụng phương pháp định lượng đã xây dựng để định lượng

tetrahydrocurcumin của chế phẩm trong 3 lô sản xuất thử nghiệm

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Định tính

Định tính THC trong chế phẩm được xác định thông qua so sánh thời gian lưu,

và phổ UV-Vis của mẫu thử và THC chuẩn trên hệ thống HPLC-DAD.

Yêu cầu: tại thời gian lưu của THC chuẩn phải xuất hiện pic THC của mẫu thử,

và phổ UV-Vis phải tương đồng nhau, có hệ số match trong khoảng 0,8-1,2.

2.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin trong chế phẩm

2.3.2.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn

Mẫu chuẩn: tiến hành cân chính xác 5mg chất chuẩn tetrahydrocurcumin hoà tan

trong vừa đủ 5ml methanol thu được dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/ml. Pha lỗng dung

dịch gốc thu được dãy chuẩn có nồng độ: 25, 50, 75, 100, 125, 150 µg/ml.

2.3.2.2. Khảo sát điều kiện pha động

Mẫu thử: Cân chính xác 1,0g mẫu thử, phân tán vào vừa đủ 25 ml với methanol.

Siêu âm 10 phút. Đem li tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút. Hút dịch phía trên lọc với

màng lọc 0,22 µm trước khi khai triển sắc ký.

Phân tích mẫu thử trong các điều kiện pha động khác nhau để chọn điều kiện tối

ưu nhất dựa trên các tiêu chí:

- Pic của THC tách hoàn toàn khỏi các pic khác.

- Pic của THC đạt yêu cầu về độ cân xứng, số đĩa lý thuyết.

2.3.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Dựa vào các tài liệu đã tham khảo, các điều kiện được cố định như sau:

- Phương pháp chiết: Siêu âm.

- Dung môi chiết mẫu: methanol.

- Thời gian chiết: 30 phút.

14



Tối ưu hố quy trình xử lý mẫu bằng cách khảo sát thể tích dung mơi: 10ml,

25ml, 50ml, 100ml / 1g mẫu.

Sau khi chiết, tiến hành ly tâm 3500 vòng/phút, thu dịch, lọc qua màng 0,22 µm

trước khi khai triển sắc ký. Lựa chọn thể tích dung mơi chiết được lượng THC tối ưu

nhất.

2.3.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích

Sau khi tối ưu hố điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu, tiến hành thẩm định

phương pháp định lượng THC trong chế phẩm bằng HPLC theo hướng dẫn AOAC.

- Độ phù hợp hệ thống

Độ thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống

phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị.

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên. Ghi lại các giá

trị thời gian lưu, diện tích pic. Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn

tương đối RSD của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu các giá trị thời gian lưu, diện tích

pic có RSD khơng q 2%.

- Độ chọn lọc

Độ chọn lọc của phương pháp là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần

phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Trong

sắc ký lỏng hiệu năng cao, độ chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ các mẫu thử,

mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các

pic tạp.

Chuẩn bị mẫu placebo, mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu placebo thêm chuẩn. So sánh

sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên. Yêu cầu: Khi chạy mẫu placebo, tại

vị trí tương ứng với tR của tetrahydrocurcumin không xuất hiện pic.

- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát

hiện được nhưng chưa thể định lượng được theo phương pháp định lượng đã xây dựng.

Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của

chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại 4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N

= Signal to noise ratio). LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 25 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N =3.

15



Giới hạn định lượng là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có

thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn.

Cách xác định tương tự như xác định LOD. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà

tín hiệu tại đó lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N= 10.

- Độ tuyến tính

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự

phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Sau khi xác

định được khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn dựa vào khoảng tuyến tính đã xác

định. Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần, tiến hành sắc ký, xây

dựng phương trình đường chuẩn và tính hệ số hồi quy tuyến tính. Thơng thường khoảng

tuyến tính được xác định bằng tối thiểu 6 điểm và đường chuẩn cần nằm trùm lên vùng

nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường chuẩn tồn bộ khoảng tuyến tính.

Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:

Hệ số hồi quy tuyến tính:

0,995≤ R ≤ 1

Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn: sau khi lập đường

chuẩn xong, kiểm tra bằng cách tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để

xây dựng đường chuẩn, từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức:

∆i = (Ct – Cc)/Cc × 100

Trong đó:

∆i: độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct: nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn.

Cc: nồng độ của các điểm chuẩn.

Giá trị ∆i không được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ

LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%.

- Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp là mức độ đồng nhất giữa các kết quả riêng biệt

khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng

nhất. Ở đây sẽ bao gồm 2 khái niệm là độ chụm và độ đúng.



16



Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực.

Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn

hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng

lớn. Để xác định độ chụm ta làm độ lặp lại và độ chính xác trung gian như sau:

Độ lặp lại: tiến hành phân tích 6 phép thử song song (xử lý mẫu, sắc ký) trên một

mẫu chế phẩm (bắt đầu từ cân hoặc đong mẫu). Tính kết quả dựa vào đường chuẩn pha

trong methanol, tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ lặp lại trong ngày bằng

cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của các lần định lượng. Hàm lượng

được tính theo cơng thức như sau:

%=



× f × 100 ×

1000 × 100 ×



Trong đó:

X (%): Hàm lượng của tetrahydrocurcumin

f: Hệ số pha lỗng

C: Nồng độ tetrahydrocurcumin tính từ phương trình đường chuẩn (µg/ml)

P: Độ tinh khiết của chất chuẩn (%) (96%)

m: Khối lượng mẫu thử (mg)

Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương

đối RSD khơng q 3,7% theo AOAC.

Độ chính xác trung gian: biểu diễn mức dao động của kết quả trong cùng một

phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau hoặc người phân tích khác nhau.

Tiến hành độc lập 6 mẫu, chạy sắc ký và tính tốn tương tự như độ lặp lại.

Yêu cầu: Khả năng lặp lại kết quả giữa các lần thử, biểu hiện bằng độ lệch chuẩn

tương đối RSD không quá 3,7% theo AOAC.

Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung

bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng (μ). Việc

xác định độ đúng của phương pháp được thực hiện thông qua xác định độ thu hồi. Thêm

lượng chất chuẩn xác định vào mẫu trắng ở 3 mức 80%, 100% và 120% so với hàm

lượng tetrahydrocurcumin trong mẫu thử, tiến hành phân tích, lặp lại tối thiểu 4 lần. Độ

thu hồi được tính theo cơng thức:

%=



100



17



Trong đó:

R%: Độ thu hồi, %

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng trong khoảng

0,1 – 1 % là: 95 – 105 % theo AOAC.

2.3.3. Các tiêu chí khác

- Cảm quan

Quan sát bằng mắt thường về thể chất, màu sắc, độ đồng nhất của gel.

Yêu cầu: nanoemulgel tetrahydrocurcumin có màu trắng, trong suốt, đồng nhất,

thể chất mịn, khơng có bọt khí.

- pH

Tham khảo tài liệu [3, 4], chúng tôi đưa ra phương pháp đo pH được tiến hành

như sau: Tiến hành pha loãng nanoemulgel tetrahydrocurcumin bằng nước cất với tỷ lệ

1:10 và đo pH trên máy MILLWAUKEE. Tiến hành trên 3 lô, mỗi lô thực hiện 3 lần và

lấy kết quả trung bình.

- Độ đồng nhất

Lấy 4 đơn vị đóng gói, mỗi đơn vị khoảng 0,02 g đến 0,03 g, trải đều chế phẩm

trên 4 phiến kính. Đậy mỗi phiến kính bằng một phiến kính thứ 2 và ép mạnh cho tới

khi tạo thành một vết có đường kính khoảng 2 cm. Quan sát vết thu được bằng mắt

thường (cách mắt khoảng 30 cm), ở 3 trong 4 tiêu bản không được nhận thấy các tiểu

phân. Nếu có các tiểu phân nhìn thấy ở trong phần lớn số các vết thì phải làm lại với 8

đơn vị đóng gói. Trong số các tiêu bản này, các tiểu phân cho phép nhận thấy không

được vượt quá 2 tiêu bản (theo phụ lục 1.12- DĐVN V) [1].

- Độ nhớt

Được đánh giá bằng máy đo độ nhớt dạng xoay

- Thiết bị đo: MRC Digital Viscometer.

- Con quay số 4.

- Tốc độ xoay 120 vòng/phút.

- Nhiệt độ 25°C.

18



- Mẫu được để ổn định 3 phút trước khi đo, thể tích mẫu 50 mL.

- Đánh giá kích thước giọt và phân bố kích thước giọt

Sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng động trên thiết bị Nano partica SZ-100

series để đo kích thước giọt và phân bố kích thước giọt. Hệ nanoemulgel được pha lỗng

với nước cất với tỷ lệ 1:10 (tt:tt), để ổn định rồi đem đi đo. Sử dụng cốc đo nhựa, chỉ số

khúc xạ RI là 1,59 và độ hấp thụ 0,01.

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Mỗi thí nghiệm làm 3 lần và lấy kết quả trung bình. Các số liệu được xử lý thống

kê để xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn tương đối RSD.

Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2016.



19



Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1. Định tính

Tiến hành khai triển sắc ký dung dịch chuẩn THC 50µg/ml và dung dịch thử với

hệ pha động là ACN- acid formic 0,1% (52:48).

So sánh sắc ký đồ, thời gian lưu, và phổ của pic chuẩn và pic thử.



THC



Thử



Chuẩn



Hình 3.1. Sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn



Chuẩn

Thử



Hình 3.2. Phổ UV-Vis của pic THC trong mẫu chuẩn và thử

Nhận xét: Thời gian lưu của THC ở mẫu thử trùng với thời gian lưu của mẫu

chuẩn (tR=9,4 phút) (xem hình 3.1). Phổ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử có hình

dạng giống nhau, có hệ số match = 1,0000 và cực đại hấp thụ của cả 2 pic là 280 nm

(xem hình 3.2).

Do vậy, có thể pic sắc ký trong sắc ký đồ của mẫu gel là của tetrahydrocurcumin.



20



3.2. Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin bằng HPLC

3.2.1. Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện sắc ký

Dựa vào các tài liệu đã tham khảo [13, 18, 32], và điều kiện của phòng thí nghiệm,

các thơng số sau đây được giữ cố định:

- Cột sắc ký Supelco- C18 250 × 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm.

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút.

- Nhiệt độ: 25ºC.

- Thể tích mẫu: 20 µl.

Các thơng số: bước sóng của detector để ghi sắc ký đồ, thành phần pha động được

khảo sát tối ưu hố.

3.2.1.1. Lựa chọn bước sóng của detector

Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn THC 50 µg/ml với hệ pha động ACN- H2O

(52:48), lấy phổ UV-Vis của pic tR = 9,4 phút cho thấy THC hấp thụ cực đại ở bước

sóng 280 nm (xem hình 3.3). Điều này cũng phù hợp với kết quả đã được công bố trước

đây [17], do vậy chúng tôi lựa chọn 280 nm là bước sóng để ghi sắc ký đồ.



Hình 3.3. Phổ UV-Vis của pic THC thu được khi phân tích dung dịch chuẩn

THC

3.2.1.2. Khảo sát tỷ lệ ACN trong pha động

Hỗn hợp ACN- H2O được chọn làm pha động xuất phát và khảo sát ở các tỷ lệ

khác nhau về thể tích (60:40, 52:48, 40:60), khi tỷ lệ ACN từ 52%, pic THC tách hoàn

toàn, giảm thêm tỷ lệ ACN chỉ kéo dài thời gian phân tích (xem kết quả trong bảng 3.1).

Vì vậy tỷ lệ ACN trong pha động được chọn ở 52%.



21



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×