Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Các kĩ thuật liên quan đến gen CDH1 và bệnh HDGC

Các kĩ thuật liên quan đến gen CDH1 và bệnh HDGC

Tải bản đầy đủ - 0trang

13



Hình 4. Mẫu mơ được bảo quản bằng paraffin

Ưu điểm của mẫu máu là dễ dàng thu thập, lưu trữ lâu dài và có thể tách

DNA cũng như RNA để phân tích [19, 20]… Tuy nhiên mơ tươi được xử lý

ngâm parafin và cố định bằng formalin là phương pháp thiết thực hơn để có

thể tiến hành nhiều nghiên cứu. Trước đây khi chưa có kĩ thuật bảo quản thì

các mơ thu thập được dễ bị thối hóa sau một thời gian. Với việc ứng dụng

các hóa chất để xử lý mẫu mơ thì hiện nay đã cải thiện chất lượng mẫu và thời

gian bảo quản có thể lên đến hàng thập kỉ. Chất lượng và số lượng DNA được

tách ra phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: loại và số lượng mẫu, cách cố định

mẫu, thời gian cố định, cách bảo quản… Trong đó, bước loại bỏ paraffin là

quan trọng nhất để có thể có được mẫu ưng ý sử dụng cho nghiên cứu [21].

3.2. Khuyếch đại gen

3.2.1. Kĩ thuật PCR thông thường

PCR là một kĩ thuật kinh điển, một trong những phương pháp quan trọng

nhất trong lĩnh vực SHPT để khuyếch đại DNA. Chỉ từ một lượng DNA rất ít

ban đầu, có thể ra hàng triệu bản sao để phục vụ phân tích, giải trình tự và

nhiều kĩ thuật khác trên gen [22]. Kĩ thuật cần sử dụng 2 đoạn mồi cho mỗi



14



đầu của đoạn DNA cần nhân lên, các nucleotid tự do và enzym DNA

polymerase bền với nhiệt để khuếch đại đoạn gen… Nếu chỉ khuếch đại một

lượng nhỏ DNA mẫu thì phương pháp này có độ chính xác rất cao. Ngồi ra

thời gian thực hiện nhanh, giá thành rẻ, dễ áp dụng rộng rãi cho nhiều nghiên

cứu nên được sử dụng trong việc phát hiện đột biến gen CDH1 [15, 23-25].

Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số nhược điểm như cần có đoạn mồi

đặc trưng và dễ bị ngoại nhiễm. Một lưu ý nữa trong nghiên cứu gen CDH1 là

phương pháp này cũng không thể dùng được để phát hiện các đột biến mất

đoạn/nhân đoạn lớn, gặp trong 4-5% số trường hợp được chẩn đốn HDGC.



Hình 5. Q trình nhân đoạn gen trong kĩ thuật PCR

3.2.2. RT-qPCR

Bên cạnh kĩ thuật PCR thông thường, RT-qPCR cũng là một phương

pháp hay được sử dụng trong các nghiên cứu về gen CDH1. Chúng thường

được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của E-cadherin – protein do gen



15



CDH1 mã hóa [20, 26]. Người mang đột biến gen CDH1 có sự giảm mức độ

biểu hiện của E-cadherin và sinh ra ung thư. Trong kĩ thuật này, vật chất di

truyền được sử dụng là mRNA, thường lấy từ mẫu máu/ mơ ngấm parafin của

bệnh nhân. Sau đó mẫu bệnh phẩm được xử lý, sử dụng enzym sao chép

ngược (reverse transcriptase) để tạo cDNA, nhân đoạn cDNA mới tạo, gắn

huỳnh quang hoặc đầu dò đặc hiệu và tiến hành phân tích định lượng (hình 6).

Có thể tham khảo kết quả phân tích của một nghiên cứu trong biểu đồ 2. Theo

đó, những người mang đột biến gen mầm có mức độ biểu hiện thấp hơn

khoảng 3 lần so với những người bình thường, sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê. Ngoài ứng dụng trên, RT-qPCR cũng được một nghiên cứu sử dụng để đánh

giá giá trị của đột biến sai nghĩa, đột biến vị trí cắt và đột biến vùng intron trong

q trình phiên mã [11, 18].



Hình 6. Mơ tả quy trình của kĩ thuật RT-qPCR



16



Biểu đồ 2. Mức độ biểu hiện của E-cadherin [20]

3.2.3. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

30-35% số bệnh nhân được chẩn đốn HDGC có thể phát hiện đột biến

gen CDH1 bằng phương pháp PCR thông thường. Tuy nhiên, nhược điểm của

các phương pháp này là khơng phát hiện được các đột biến xóa/thêm đoạn lớn

trong các exon, tạo ra các biến thể số lượng bản sao (Copy number variant CNV) vốn chiếm 4-5% số trường hợp HDGC. Vì vậy, với những trường hợp

khơng phát hiện được các đột biến có ý nghĩa, cần tiến hành phương pháp

MLPA [17].



17



Hình 7. Các dạng biến thể số lượng bản sao (CNV) [27]

Để thực hiện kĩ thuật này, đầu tiên cần biến tính DNA thành dạng sợi

đơn, lai với đoạn dò MLPA ở vị trí nhất định của cấu trúc exon cần nghiên

cứu. Đoạn dò là 2 đoạn oligonucleotid riêng biệt ở 2 đầu 5’ và 3’ có gắn

huỳnh quang của các đoạn cần nghiên cứu. Sau đó hiện tượng gắn xảy ra giữa

2 đoạn dò khi chúng có thể lai được với đoạn gen cần giải mã (hình 8). Phản

ứng PCR sau đó được tiến hành và sản phẩm được tạo ra sẽ được đánh giá

dựa trên lượng huỳnh quang đo được sau khi thực hiện PCR. Kết quả này cần

được đối chứng với một nhóm chứng để phân tích [28].



18



Hình 8. Quy trình của một phản ứng MLPA

Biểu đồ 3 thể hiện kết quả nghiên cứu về mất đoạn gen CDH1 của tác

giả Olivera. Khi đối chiếu với nhóm chứng, kết quả cho thấy ở bệnh nhân này

đã có mất đoạn gen ở exon 14,15 và 16.



19



Biểu đồ 3. Kết quả phân tích MLPA [29]

Ưu điểm của kĩ thuật này là có thể so sánh với nhóm chứng và phát hiện

được hiện tượng xóa/thêm đoạn lớn. Tuy nhiên do tính chất của kĩ thuật này

mà việc phát hiện chính xác điểm gây đột biến khó chính xác. Ngồi ra kết

quả của phương pháp cũng khơng giúp khẳng định nguyên nhân gây hiện

tượng lặp đoạn nằm ở cấu trúc nào của DNA [28].

3.2.4. Multiplex PCR

Multiplex PCR là kĩ thuật chuyên sâu với đặc trưng là khả năng nhân lên

nhiều đoạn gen cùng một lúc với chỉ một lượng mẫu bệnh phẩm ban đầu

(hình 8). Nếu như PCR thơng thường thì chỉ có thể nhân từng đoạn gen trong

một lần thực hiện kĩ thuật thì Multiplex PCR có thể nhân rất nhiều đoạn gen

phục vụ cho nghiên cứu lớn. Nhờ kĩ thuật này mà chi phí phân tích hệ gen

giảm đi đáng kể so với việc PCR từng đoạn gen đơn lẻ. Ngoài ra, những ưu

điểm quan trọng khác là giảm thời gian thao tác bằng tay, khả năng đối chứng

nội kiểm nhằm đánh giá chất lượng của PCR, xác định được chất lượng

mẫu… Tuy nhiên nhược điểm là phụ thuộc nhiều vào chất lượng của PCR

mastermix, khả năng nhân lên kém hơn và phụ thuộc vào chất lượng DNA.

Thơng thường phương pháp này ít được sử dụng đại trà. Ứng dụng quan trọng

nhất của Multiplex PCR là giúp cho các nghiên cứu quy mơ lớn cần phân tích

nhiều gen một lúc.



20



Hình 8. Phương pháp multiplex PCR

Tuy CDH1 được xác định là gen gây bệnh chính trong HDGC, nhưng

đột biến gen này mới chỉ chiếm khoảng 30% số trường hợp được chẩn đốn

HDGC. Có đến 50-70% số trường hợp vẫn chưa tìm được đột biến gây bệnh.

Đây có thể là đột biến của các gene khác mà các nhà khoa học vẫn chưa phát

hiện ra. Đối với những trường hợp này, cần phân tích multiplex PCR và giải

trình tự nhằm tìm ra những gen mới gây bệnh HDGC. Một số gen tiềm năng

đang được cho là có liên quan đến bệnh HDGC là CTNNA1, PALB2,

RECQL5, MSH2… [17, 30, 31]. Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào

khẳng định chắc chắn đây là các gen gây bệnh bên cạnh CDH1. Vì vậy, việc

phân tích multiplex PCR cần được thực hiện cho trường hợp HDGC nhưng

CDH1 âm tính nhằm tìm ra các đột biến gen và giúp hiểu thêm về cơ chế gây

bệnh.

3.3. Giải trình tự gen



21



3.3.1. Direct Sequencing

Giải trình tự gen trực tiếp là phương pháp kinh điển để phát hiện đột biến

gen. Các bước tiến hành tương đối tương giản. Đầu tiên DNA sợi kép được

tách thành sợi đơn, sau đó được chia làm 4 ống. Mỗi ống bao gồm một đoạn

mồi oligonucleotid, DNA polymerase và hỗn hợp 4 loại nucleotid dNTP

(dATP, dTTP, dCTP, dGTP) và 1 trong 4 loại dideoxynucleotid có đánh dấu

đồng vị phóng xạ ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) để tạo các cấu trúc

kép mới. các đoạn gen sẽ được ghép đôi bằng dNTP cho đến khi ddNTP gắn

vào. Quá trình giải trình tự sẽ dừng lại tại vị trí này, tạo các đoạn DNA có độ

dài khác nhau. Sau đó mẫu này được đưa vào điện di trên môi trường gel

Polyacrylamide hoặc Agarose để giải trình tự gen (hình 9).



Hình 9. Kĩ thuật giải trình tự gen trực tiếp



22



Hình 10. Đột biến c.1212delC phát hiện bằng Direct sequencing [32]

Ưu điểm của phương pháp này là giá thành rẻ, dễ thực hiện và khả năng

phát hiện đột biến tốt. Chúng có nhược điểm là thời gian để nhận kết quả lâu,

có thể lên đến vài ngày tùy thuộc vào chiều dài đoạn gen. Ngoài ra, với các

mẫu mơ được thu thập từ vị trí khối u thì độ đặc hiệu của phương pháp giảm

đi, dễ gây âm tính giả. Tuy vậy nhờ những ưu thế của phương pháp này mà

phần lớn các nghiên cứu về gen CDH1 nói riêng và gen nói chung mà chúng

vẫn là sự lựa chọn hàng đầu để phát hiện bất thường.

3.3.2. Bisulfite Sequencing

Một trong những cơ chế quan trọng khởi phát ung thư là sự thay đổi của

hệ epigenetic. Epigentic có thể hiểu đơn giản là “những thay đổi kiểu hình di

truyền ổn định ở chromosome mà không do thay đổi ở chuỗi DNA” [33].

Bình thường, epigenetic có khả năng methyl hóa DNA, thay đổi sau dịch mã,

tái cấu trúc nucleosome, điều hòa RNA khơng mã hóa…[34, 35]. Theo đó,

những người có biến đổi ở hệ này làm thay đổi biểu hiện của gen và mất cân

bằng hệ gen. Sự methyl hóa vùng promoter của gen có thể bật hoạt gen ức chế

sinh u, tạo điều kiện để khối u phát triển.

Một trong những phương pháp đánh giá tác động của hệ epigenetic là

bisulfite sequencing. Cơ chế của bisulphit sequencing là dùng bisulphite để



23



chuyển methyl-Cytosine thành Uracil, mức độ methyl hóa của đoạn DNA

được dựa trên mức độ methyl hóa của các cytosine. Mức độ methyl hóa càng

nhiều thì gen càng dễ bị bất hoạt. Một số nghiên cứu ghi nhận sự bất thường

của hệ này làm bất hoạt gen mầm CDH1 hoặc đóng vai trò cơ chế bất hoạt thứ

2, gây ra ung thư [11, 36, 37]



Hình 11. Các bước của kĩ thuật Bisulfite sequencing

3.3.3. Next Generation Sequencing (NGS)

Với yêu cầu giải trình tự tồn bộ hệ gen hiệu quả hơn, rất nhiều nguồn

lực được đổ vào nhằm nâng cao tốc độ giải trình tự gen và giảm giá thành của

phương pháp này. Một trong những ứng dụng quan trọng đóng góp vào q

trình này là sự ra đời của Next generation sequencing (NGS). Công nghệ này

thực sự là một cuộc cách mạng. Nhờ ưu thế là công suất cao (high

throughput), thời gian ngắn, chi phí thấp đã giúp giấc mơ giải trình tự tồn bộ

hệ gen người với mức giá dưới 1000 đô la Mỹ thành hiện thực [38].

Trong các sản phẩm trên thị trường thì 4 phương pháp chính dẫn đầu là

454 Pyrosequencing, Ilumina và SOLiD và Ion Torrent. Dù áp dụng công

nghệ khác nhau nhưng đều trải qua 3 bước chính: chuẩn bị thư viện DNA (cắt

DNA thành các đoạn nhỏ) và gắn lên giá bám, khuếch đại và giải trình tự. Tùy



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Các kĩ thuật liên quan đến gen CDH1 và bệnh HDGC

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×