Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Ứng dụng của sinh học phân tử trong nghiên cứu gen CDH1 và HDGC

Ứng dụng của sinh học phân tử trong nghiên cứu gen CDH1 và HDGC

Tải bản đầy đủ - 0trang

10



Không phải cứ xuất hiện đột biện gen CDH1 sẽ biểu hiện bệnh. Nguy cơ

mắc tích lũy UTDD tính đến 80 tuổi là 70% ở nam và 56% ở nữ. Bên cạnh

đó, có thể các trường hợp có đột biến gen nhưng là lành tính, khơng có khả

năng gây bệnh [9]. Các dạng đột biến thường gặp là cắt đoạn protein (bao

gồm đột biến dịch khung và đột biến vô nghĩa, đột biến chỗ nối) chiếm 75%.

Còn lại 25% là đột biến sai nghĩa gây ảnh hưởng đến chức năng. Phương

pháp phân tích cơ bản có thể phát hiện được phần lớn các dạng đột biến của

gen CDH1. Tuy nhiên vẫn có tỉ lệ nhất định trường hợp khơng phát hiện được

đột biến khi sử dụng các phương pháp phân tích phổ thơng mà cần những

phương pháp phân tích khác bên cạnh PCR thông thường để phát hiện ra

bệnh.

2.2. Tổng quan các phương pháp phân tích, cách tiếp cận chẩn đốn gen

CDH1

Bên cạnh yếu tố lâm sàng, các cơng cụ sinh học phân tử là điều rất cần

thiết để xác định chính xác các bất thường của hệ gen. Phát hiện đột biến gen

CDH1 và nguyên nhân gây bệnh CDH1 cần cách tiếp cận đa mơ thức và vẫn

chưa có giải pháp tối ưu để đánh giá tổng thể [10, 11]. Mỗi phương pháp có

ưu nhược điểm riêng, tùy từng trường hợp mà có thể đánh giá lựa chọn

phương pháp phù hợp. Các yếu tố cần được cân nhắc để đánh giá là khả năng

áp dụng và hạn chế của các phương pháp phân tích, khả năng kinh tế, tính

chất của nghiên cứu... Ngoài ra, do yêu cầu của từng cách tiếp cận và đặc

điểm của từng nghiên cứu mà ngay từ khâu lựa chọn mơ bệnh học đã có

những lưu ý nhất định để có thể nghiên cứu các đột biến.

Cách tiếp cận cơ bản để phát hiện các trường hợp có thể có đột biến gen

CDH1 có thể tham khảo biểu đồ 1. Đối tượng là những người thân của bệnh

nhân và chính những bệnh nhân được chẩn đoán HDGC bằng Hướng dẫn

đồng thuận của tổ chức International Gastric Cancer Linkage Consortium



11



(IGCLC) [12]. Những đối tượng này sẽ được tiến hành tư vấn và sàng lọc gen

CDH1. Các phương pháp có thể sử dụng có thể chỉ là PCR và sequencing

thơng thường, nhưng cũng có thể cần thêm các phương pháp khác mới hơn

như MLPA, quatitative PCR (qPCR), RT-PCR, multiplex sequencing,

pyrosequencing, bisulfite sequencing … Những trường hợp phát hiện đột biến

gen sẽ cần phải đánh giá loại đột biến là sai nghĩa hay mất đoạn. Các trường

hợp gây đột biến mất đoạn thì đều là những người có nguy cơ cao mắc bệnh

và cần những biện pháp theo dõi và điều trị dự phòng dựa theo khuyến cáo

[12]. Những người có đột biến sai nghĩa thì cần xác định khả năng gây bệnh của

đột biến theo phân độ của trường Cao đẳng về Gen và hệ Gen Hoa Kỳ và Hiệp

hội Bệnh học phân tử [13].



Biểu đồ 1. Các tiếp cận cơ bản với các trường hợp UTDD gia đình [14]

Dựa theo bảng 1 về giá trị của các phương pháp phân tích, có thể thấy

những phương pháp thông thường chỉ xác định được 30% số trường hợp, 4-



12



5% còn lại cần những phương pháp chuyên sâu hơn để có thể tìm ra các đột

biến gây bệnh. Tuy vậy vẫn còn đến 50-70% số trường hợp được chẩn đoán là

HDGC nhưng chưa phát hiện được các gen gây bệnh. Đây là khoảng trống mà

khoa học vẫn chưa tìm ra. Vì vậy các nhà nghiên cứu vẫn cần tiếp tục tìm ra

các cơ chế mới và xác định được các gen gây bệnh.

Bảng 1. Ý nghĩa của các phương pháp đánh giá đột biến gen CDH1 [9]

Gene

CDH1



Phương pháp đánh giá



Tỉ lệ mang đột biến

gen được phát hiện



Giải trình tự gen thơng thường

Phân tích đột biến mất/thêm đoạn gene



30%-50%

4%



Chưa rõ NA

3. Các kĩ thuật liên quan đến gen CDH1 và bệnh HDGC

3.1. Lựa chọn mẫu bệnh phẩm

Thông thường, các nghiên cứu có thể sử dụng nhiều dạng mơ để phân

tích như máu, mẫu mô (tươi hoặc đúc trong khối nến paraffin), nước bọt, tóc

hoặc vị trí trừ da. Tuy nhiên, HDGC là một bệnh hiếm gặp, cần thu thập mẫu

trong thời gian dài và quy mơ lớn. Vì vậy, việc sử dụng mơ tươi là điều khá

khó khăn. Do đó bệnh phẩm được sử dụng trong các nghiên cứu thường là mô

đã được đúc trong khối nến parafin (từ mảnh sinh thiết tại vị trí tổn thương

hoặc biểu mơ dạ dày bình thường), mẫu máu (có thể là mẫu mới hoặc đã được

lưu trữ) và nước bọt [15-18]. Các mẫu mơ này sau đó sẽ tiến hành qua các

bước như phá màng tế bào, màng nhân; loại protein và tủa acid nucleic để lấy

ra vật chất di truyền dùng cho q trình phân tích. Các mẫu mơ thu thập được

nên được tiếp tục lưu trữ nhằm phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn về sau.



13



Hình 4. Mẫu mơ được bảo quản bằng paraffin

Ưu điểm của mẫu máu là dễ dàng thu thập, lưu trữ lâu dài và có thể tách

DNA cũng như RNA để phân tích [19, 20]… Tuy nhiên mô tươi được xử lý

ngâm parafin và cố định bằng formalin là phương pháp thiết thực hơn để có

thể tiến hành nhiều nghiên cứu. Trước đây khi chưa có kĩ thuật bảo quản thì

các mơ thu thập được dễ bị thối hóa sau một thời gian. Với việc ứng dụng

các hóa chất để xử lý mẫu mơ thì hiện nay đã cải thiện chất lượng mẫu và thời

gian bảo quản có thể lên đến hàng thập kỉ. Chất lượng và số lượng DNA được

tách ra phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: loại và số lượng mẫu, cách cố định

mẫu, thời gian cố định, cách bảo quản… Trong đó, bước loại bỏ paraffin là

quan trọng nhất để có thể có được mẫu ưng ý sử dụng cho nghiên cứu [21].

3.2. Khuyếch đại gen

3.2.1. Kĩ thuật PCR thông thường

PCR là một kĩ thuật kinh điển, một trong những phương pháp quan trọng

nhất trong lĩnh vực SHPT để khuyếch đại DNA. Chỉ từ một lượng DNA rất ít

ban đầu, có thể ra hàng triệu bản sao để phục vụ phân tích, giải trình tự và

nhiều kĩ thuật khác trên gen [22]. Kĩ thuật cần sử dụng 2 đoạn mồi cho mỗi



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Ứng dụng của sinh học phân tử trong nghiên cứu gen CDH1 và HDGC

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×