Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG HAI: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG HAI: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

19



- Hóa chất pha mẫu dược liệu: Dimethyl sulfoxide (VWR- BDH prolabo).

- Hóa chất pha đệm: Natri tetraborate, NaCl - (Sigma).

- Benzene sulfonyl chloride 99% (BSC) - (Sigma).

- Quinoline 99% - (Acros Organics).

- HCl 1M, Ethanol absolute for analysis - (Merck).

2.1.3. Máy móc, thiết bị, dụng cụ.

 Cho chuẩn bị cao dược liệu.

- Cân, máy đo hàm ẩm, bể điều nhiệt, bộ sinh hàn.

- Bình cầu chiết dung tích 0,5 L, 1 L, 2 L.

- Máy thu hồi dung môi áp suất giảm.

 Cho thí nghiệm đánh giá hoạt động ức chế enzym

- Cân phân tích, máy đo pH, bể siêu âm, thiết bị khuấy từ.

- Bể điều nhiệt SHEL LAB.

- Máy voltage MS1 minishaker.

- Tủ hút.

- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek) ELx808.

- Máy lắc nghiêng mini Rocker -Shaker BioSan.

- Đĩa UV 96 giếng đáy phẳng SPL Life Science.

- Micropipet một đầu kênh với các thể tích: 0,5-10 µl, 2-20 µl, 10-100 µl, 50200 µl, 100-1000 µl -Eppendorf.

- Microtube thể tích 1,5 ml, 15 ml, 50 ml -Eppendorf.



20



Hình 2.1: Hệ thống đo ELISA 96 giếng - EL x808 Biotek.

2.2.



Nội dung nghiên cứu.

Để thực hiện mục tiêu đề ra, đề tài được thiết kế với 3 nội dung:



(1). Chuẩn bị các cao chiết từ 8 mẫu dược liệu được nêu trong Bảng 2.1.

(2). Sàng lọc tác dụng của các mẫu cao dược liệu tại Việt Nam trên thí nghiệm

đánh giá tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin.

+ Chuẩn bị mẫu thử in vitro.

+ Tiến hành thử với các mẫu dược liệu pha với nồng độ 100 µg/ml; 50 µg/ml.

(3). Xác định IC50 của cao dược liệu có khả năng ức chế ACE tốt nhất.

2.3.



Phương pháp nghiên cứu.



2.3.1. Chuẩn bị cao chiết.

 Cao chiết tổng (cao nước và cao cồn 500)

+ Nguyên tắc: chiết hồi lưu. Dược liệu chia nhỏ, được ngâm cùng dung môi trong

một bình cầu đáy tròn thể tích 500 ml được nối với hệ thống ngưng tụ. Đun nóng bình

cầu chứa dược liệu và dung môi đến nhiệt độ sôi, dung môi bốc hơi sẽ ngưng tụ và

quay trở lại bình chiết.

+ Dung môi: nước hoặc Ethanol 500 tương ứng cao tổng chiết nước và cao tổng

chiết cồn.

+ Chiết 3 lần, thời gian mỗi lần 2 giờ 30 phút – 2 giờ - 2 giờ.

+ Tỉ lệ dung môi ở 3 lần chiết so với khối lượng dược liệu (sau đây sẽ gọi tắt là tỉ

lệ dung môi): 10/8/8.

Dịch chiết mỗi lần được lọc, gộp dịch lọc, bốc hơi dung môi thu được cao tổng.



21



Hình 2.2: Sơ đồ chiết cao tổng dược liệu.

 Cao chiết phân đoạn

+ Cho dược liệu đã chia nhỏ, cân vào bình cầu đáy tròn thể tích 2 L được nối với

hệ thống ngưng tụ. Đun nóng bình cầu chứa dược liệu và dung môi đến nhiệt độ sôi,

dung môi bốc hơi sẽ ngưng tụ và quay trở lại bình chiết.

+ Dung mơi là cồn 900 được thêm vào, tỉ lệ dung môi là 10/8/8 ở ba lần chiết (đảm

bảo rằng dung môi ngập hết dược liệu).

+ Lọc dịch chiết mỗi lần, gộp dịch lọc. Cất thu hồi dung mơi dưới áp suất giảm.

+ Dịch còn lại sau khi thu hồi dung môi, thêm vào lượng nước tối thiểu. Sau đó

tiến hành lắc phân đoạn trong bình chiết với thứ tự các dung môi: n-hexan,

diclomethan, ethyl acetat và n-butanol, giữ lại phần dung dịch nước cuối cùng. Các

phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 5 phân

đoạn cao chiết tương ứng (kể cả phần dung dịch nước cuối cùng).



22



Hình 2.3: Sơ đồ chiết cao phân đoạn.

 Dược liệu lá hồng:

- Cao chiết ethanol 70%: Mẫu lá hồng được sấy khô ở 500C đến giòn, sau đó

làm nhỏ. Chiết nóng hồi lưu 3 lần 100 g lá hồng với ethanol 700, mỗi lần hai giờ với

tỉ lệ dung môi là 10/8/8. Lọc dịch chiết sau mỗi lần. Dịch chiết được gộp lại, cất loại

dung môi dưới áp suất giảm để loại Ethanol tới khối lượng không đổi thu được cao

khô làm mẫu thử.

- Cao chiết khô giàu flavanoid: mẫu lá hồng được sấy khơ đến giòn. Chiết nóng

hồi lưu 3 lần 1000 g lá hồng với ethanol 700, mỗi lần 2h với tỉ lệ dung môi là 10/8/8.

Lọc dịch chiết sau mỗi lần. Dịch chiết được gộp lại, cất loại dung mơi dưới áp suất

giảm để loại ethanol tới còn khoảng 1,5 L. Lắc dịch chiết thu được với EtAc đến khi



23



dịch chiết nhạt màu. Gộp phân đoạn EtAc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu

được cao khô giàu flavonoid.

2.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin của cao dược liệu.

Từ mơ hình ức chế enzym chuyển hóa angiotensin ban đầu thực hiện bởi

Cushman và Cheung vào năm 1971, sau đó được phát triển thêm bởi Li và cộng sự

vào năm 2005 [33], chúng tôi tiến hành thử nghiệm và có một số điều chỉnh với điều

kiện phòng thí nghiệm và hóa chất tại khoa Dược lí - Hóa sinh – Viện Dược liệu.

2.3.2.1.



Ngun tắc.



Dựa trên phản ứng thủy phân của ACE trên cơ chất Hippuryl-Histidyl-Leucin

(HHL), tạo thành Hippuric axit và Histidyl- Leucin.

H3C



H



O

C



N

H



H3C



CH3



O

C



N

H



C



O

C



H

N



O



ACE



CH2

N

H



C



CH2

N

H



C



OH



O

HN



His-Leu



N



OH



O

HN



CH3



N



Hip-His-Leu



O

C



N

H



C



OH



O



Axit Hippuric



Hình 2.4: Cơ chế phản ứng thủy phân HHL của ACE [16].

HA tạo thành được xác định dựa vào phản ứng tạo màu đặc trưng với benzenesulfonyl-chloride trong sự có mặt của quinolin. Sau đó được định lượng bằng phương

pháp đo quang ở bước sóng 490 nm. Mẫu có chất thử được so sánh với mẫu khơng

có chất thử để đánh giá tác dụng ức chế của chất thử.



24



2.3.2.2.



Chuẩn bị các dung môi, hóa chất.



- Đệm borat: 50 mM borat, pH 8,3 và 0,3 M NaCl.

- ACE: 0,02 U/ml (sau khi pha được bảo quản ở -200C).

- Cơ chất: HHL 2,5 mM (sau khi pha được bảo quản ở -200C).

- Hóa chất dừng phản ứng: HCl 1M.

- Phản ứng tạo màu: BSC, Quinolin.

- Dung môi: Ethanol dùng cho phản ứng sinh học phân tử.

2.3.2.3.



Chuẩn bị mẫu thử in vitro



 Chuẩn bị mẫu thử in vitro: Các cao dược liệu thu được sau chiết, bao gồm cao

tồn phần và 5 phân đoạn được hòa tan trong dung môi dimethyl sulfoxid

(DMSO) để được dung dịch gốc 100 mg/ml. Từ dung dịch gốc, pha loãng bằng

đệm borat pH 8.3 để thu được các nồng độ thích hợp để tiến hành các phản

ứng enzym.

 Captopril: Captopril được pha trong đệm borat thành dãy các nồng độ phù hợp

để xác định IC50.

2.3.2.4.



Đánh giá ảnh hưởng của mẫu cao dược liệu, thực vật lên hoạt độ ACE.



Thí nghiệm hoạt động ức chế ACE: tiến hành trong các ống 1.5 ml.

 Bố trí thí nghiệm:

Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm.

Hóa chất/Dung



Ống chứng



Ống trắng



Ống thử (T)



Ống trắng thử



mơi



(C)



chứng (B)



Đệm borat (µl)



40



50



27,5



37,5



Chất ức chế (µl)



0



0



12,5



12,5



Enzym (µl)



10



0



10



0



HHL (µl)



75



75



75



75



HCl (µl)



100



100



100



100



Quinolin (µl)



150



150



150



150



BSC (µl)



75



75



75



75



(B)



25



EtOH (µl)



300



300



300



300



 Quy trình thí nghiệm

Ống thử: Trong ống nhựa 1,5 ml có nắp, cho 12,5 µl mẫu thử, 27,5 µl đệm

borat. Thêm 10 µl ACE 0,02 U/ml, sau đó lắc nhẹ. Sau khi ủ 5 phút ở 370C, thêm 75

µl HHL 2,5 mM , lắc trong 10 giây. Sau khi ủ 30 phút ở 370C, tiếp tục thêm 100 µl

HCl 1M để dừng phản ứng enzym. Hỗn hợp phản ứng sau đó được thêm lần lượt 150

µl Quinolin và 75 µl BSC. Quá trình cho Quinolin và BSC được thực hiện trong tủ

hút, ở điều kiện tránh ánh sáng. Hỗn hợp phản ứng sau đó được ủ trong 45 phút trên

máy lắc nghiêng, trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ 250C.

Dung dịch phản ứng sau đó được pha lỗng bằng 300 µl EtOH. Hút 200 µl hỗn

hợp phản ứng vào mỗi giếng trong đĩa 96 giếng. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm

ở máy đo quang ELISA Biotek. Mỗi dung dịch đo hai giếng và lấy trị số trung bình

của hai giếng.



26



Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế ACE.

Ống chứng được tiến hành tương tự ống thử nhưng thay mẫu thử bằng đệm.

Ống trắng tương ứng của ống chứng (thử) được tiến hành tương tự ống chứng

(thử) nhưng thay enzym bằng đệm.

- Trước đó, tiến hành với mẫu thử là DMSO để đánh giá mức độ ảnh hưởng

của DMSO lên hoạt động của ACE ở các nồng độ 0,5%, 0,1%, 0,01%. Nồng độ lựa

chọn dựa trên nồng độ DMSO cao nhất trong mẫu phản ứng.

- Mẫu thử là các cao toàn phần, phân đoạn của các dược liệu được pha trong

đệm ở 2 nồng độ 100 µg/ml và 50 µg/ml.

- Song song với mỗi mấu chứng, mẫu thử có một mẫu trắng của chứng, mẫu

trắng của thử được tiến hành tương tự nhưng khơng cho enzym.

 Đánh giá kết quả

Tính I (% ức chế theo công thức)



27



I=



ΔODchứng – ΔODthử



ΔODchứng = ODchứng – OD trắng chứng



ΔODchứng



x 100% (1)



ΔODchứng = ODthử – OD trắng thử

OD: độ hấp thụ của mẫu đo ở bước sóng 490 nm.

2.3.2.5.



Xác định IC50 của mẫu dược liệu có khả năng ức chế ACE mạnh nhất.



Tác dụng ức chế ACE của các cây được đánh giá theo trị số IC50 là giá trị nồng

độ (tính tốn theo lí thuyết) tại đó mẫu ức chế 50% hoạt tính của ACE dưới điều kiện

thí nghiệm và được các định bằng phân tích hồi quy sự ức chế ACE (%) (nồng độ ức

chế) (µM hoặc µg/ml).

Với từng mẫu được lựa chọn, thiết lập dãy nồng độ khảo sát, từ đó xác định IC50

và giới hạn khoảng tin cậy.

 Bố trí thí nghiệm: Như mơ tả ở mục 2.3.2.4.

- Mẫu thử là cao của các mẫu dược liệu có tác dụng ức chế ACE tốt nhất được

pha trong đệm thành một dãy 5 nồng độ khác nhau.

- Song song với mỗi mẫu chứng, mẫu thử có một mẫu trắng của chứng, mẫu

trắng của thử được tiến hành đồng thời.

- Ngồi ra, tiến hành thí nghiệm xác định IC50 của mẫu đối chứng dương

captopril.

 Đánh giá kết quả.

- Tính I (% ức chế theo cơng thức (1)).

- Xác định nồng độ ức chế 50% hoạt động ACE của từng mẫu.

2.3.2.6.



Phương pháp xử lí số liệu.



Kết quả thu được là giá trị trung bình của hai giếng đo đồng thời.

Số liệu được lưu trữ bằng phần mềm Microsoft Excel và tính I% ở các nồng

độ 100 µg/ml và 50 µg/ml.

Tính IC50 bằng phần mềm GraphPad Prism 8.0.2.



28



CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.

3.1 Kết quả.

3.1.1. Khối lượng cao dược liệu thu được.

Bảng 3.1: Chuẩn bị mẫu cao chiết.

Tên mẫu



Khối lượng



Khối lượng



Hiệu suất



cân ban đầu



cao thu được



tương đối (%)



(g)



(g)

-Hàm ẩm (%)



Lược vàng cao nước



6,00



1,75-1,3



29,17



Lược vàng cao cồn 500



5,64



2,04



36,17



Lược vàng



n-Hexan



41,00



0,99



2,41



chiết cồn 90



DCM



41,00



0,25



0,60



EtAc



41,00



0,74



1,80



BuOH



41,00



0,73



1,88



Cắn nước



41,00



-



-



Đỗ trọng cao nước



21,87



3,87



17,70



Đỗ trọng cao cồn 500



19,17



3,51



18,31



Đỗ trọng chiết



n-Hexan



99,19



1,23



1,24



cồn 90



DCM



99,19



0,23



0,23



EtAc



99,19



0,21



0,21



BuOH



99,19



2,80 - 0,64



2,82



Cắn nước



99,19



4,45



4,49



Dừa cạn cao nước



10,00



3,12



31,25



Dừa cạn cao cồn 500



10,00



2,99



29,94



Dừa cạn chiết



n-Hexan



110,00



3,11



2,82



cồn 90



DCM



110,00



2,96



2,69



EtAc



110,00



1,09



0,99



BuOH



110,00



3,14



2,85



29



Cắn nước



110,00



-



-



Cần tây cao nước



10,00



3,42



34,21



Cần tây cao cồn 500



10,00



3,51



35,10



Cần tây chiết



n-Hexan



27,00



0,16



0,57



cồn 90



DCM



27,00



0,21



0,78



EtAc



27,00



0,28



1,05



BuOH



27,00



0,68



2,53



Cắn nước



27,00



-



-



Xa kê cao nước



9,81



1,47 - 1,71



14,98



Xa kê cao cồn 500



11,47



1,68



14,65



Xa kê chiết



n-Hexan



103,71



2,25



2,17



cồn 90



DCM



103,71



3,33 - 9,65



3,21



EtAc



103,71



0,08



0,08



BuOH



103,71



0,82



0,79



Cắn nước



103,71



4,09



3,94



Gối hạc (lá, cành) cao nước



10,94



0,90-1,66



8,23



Gối hạc (lá, cành) cao cồn



10,87



1, 06



9,75



500

Gối hạc (lá,



n-Hexan



104,77



0,93



0,89



cành) chiết



DCM



104,77



0,06



0,06



cồn 90



EtAc



104,77



0,58



0,55



BuOH



104,77



1,10



1,05



Cắn nước



104,77



3,78 – 0,56



3,61



Gối hạc (thân rễ) cao nước



21,01



2,60 - 7,69



12,38



Gối hạc (thân rễ) cao cồn 500



20,05



4,80



23,94



Gối hạc (thân



n-Hexan



104,77



0,22



0,21



rễ) chiết cồn



DCM



104,77



0,17



0,16



90



EtAc



104,77



3,19 - 4,23



3,04



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG HAI: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×