Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
- Kỹ thuật tiến hành nội soi tại khoa Tiêu hóa và Trung tâm nội soi tiêu hóa Việt Nam - Nhật Bản Bệnh viện Bạch Mai. Qua nội soi các bệnh nhân được sinh thiết niêm mạc tại vùng tổn thương bằng kìm sinh thiết: Auto clave modern FB-24KE của hãng Olympus và

- Kỹ thuật tiến hành nội soi tại khoa Tiêu hóa và Trung tâm nội soi tiêu hóa Việt Nam - Nhật Bản Bệnh viện Bạch Mai. Qua nội soi các bệnh nhân được sinh thiết niêm mạc tại vùng tổn thương bằng kìm sinh thiết: Auto clave modern FB-24KE của hãng Olympus và

Tải bản đầy đủ - 0trang

45



Hình 2.1. Máy nội soi Fujnon - XL4450

- Dụng cụ nội soi:

+ Máy nội soi: Sử dụng máy nội soi cửa sở thẳng tại khoa tiêu hố Bệnh

viện Bạch Mai.

+ Kìm sinh thiết

+ Dung dịch cố định bệnh phẩm: Formol 10%.

+ Tiêu bản

- Chuẩn bị bệnh nhân trước khi nội soi: làm sạch đại tràng bằng foctrant

theo qui trình và phân loại vị trí tổn thương theo Montreal - trích dẫn từ tài liệu

như sau:

+ Viêm loét trực tràng (proctitis): tổn thương chỉ ở trực tràng.

+Viêm đại tràng trái (left - sided colitis): từ trực tràng lên đến đại tràng

góc lách.

- Viêm đại tràng tồn bợ (Extensive colitis): Tởn thương lan tỏa từ manh

tràng đến đại tràng góc lách.

Trong kỹ thuật soi chúng tôi soi kiểm tra đến hồi tràng ở tất cả các

bệnh nhân.

2.3.2. Kỹ thuật sinh thiết làm mô bệnh học:



46



Vị trí sinh thiết: là vùng tổn thương của đại trực tràng. Sinh thiết ít nhất

03 mảnh ở các vị trí khác nhau.

Mẫu bệnh phẩm (Tissue sampling) sau khi sinh thiết đều để chung

trong 1 lọ bảo quản bằng Formol 10% và chuyển đến Trung tâm Giải phẫu bệnh

- Bệnh viện Bạch Mai.

+ Mô bệnh học: được tiến hành tại Trung tâm Giải phẫu bệnh Bệnh viện

Bạch Mai. Sau khi thu thập mẫu bệnh phẩm đảm bảo về số lượng mảnh sinh

thiết và bảo quản đúng quy trình. Bệnh phẩm được nhuộm kỹ thuật HE và PAS.

Sử dụng kính hiển vi quang học Nikon ở các độ phóng đại khác nhau (40, 100

và 200 lần) để quan sát tổn thương. Kết quả được đánh giá theo tiêu chuẩn

Nottingham 2000 bởi các chuyên gia đầu ngành mô bệnh học.

2.3.3. Kỹ thuật lấy máu xét nghiệm sinh hóa, huyết học và miễn dịch

Sau khi bệnh nhân được chẩn đoán VLĐTTCM trên lâm sàng và nội

soi tiến hành lấy máu làm các xét nghiệm công thức máu, máu lắng, CRPhs,

albumin, điện giải đồ, globulin miễn dịch, điện di protein và các cytokine.

Lấy máu tĩnh mạch được tiến hành trên 78 bệnh nhân (nhóm bệnh) và 30

người đến khám vì kiểm tra sức khỏe (nhóm chứng). Thời điểm lấy máu là

trước 9 giờ sáng, chưa ăn sáng. Trước đó chưa được dùng thuốc điều trị nào

hoặc dùng chế phẩm nào ức chế miễn dịch.

+ Các xét nghiệm huyết học: tiến hành tại khoa huyết học Bệnh viện

Bạch Mai và thực hiện trên máy XT - 400 của Sysmexa.

+ Các xét nghiệm sinh hóa: tiến hành tại Khoa Sinh hóa Bệnh viện

Bạch Mai để xét nghiệm định lượng globulin huyết thanh trên hệ thống máy

sinh hóa - miễn dịch Cobas 8000 của hãng Roche.

+ Xét nghiệm điện di protein huyết thanh: tiến hành thực hiện tại Khoa

Huyết học được xét nghiệm bằng phương pháp miễn dịch cố định tiến hành tại

khoa Huyết học Bệnh viện Bạch Mai trên máy Hydrasys 2 scan của Sebia (Pháp).



47



Hình 2.2. Máy điện di protein Hydrasys 2 scan của Sebia

+ Xét nghiệm TNF-α, IL-1β,IL-6, IL-8,IL-10 trong huyết thanh: Lấy

2ml máu vào ống nghiệm không có thuốc chống đông sau đó ly tâm tách lấy

huyết thanh để xét nghiệm.

- Sinh phẩm xét nghiệm: Bộ sinh phẩm phát hiện đồng thời 9 cytokine

của người (gồm GM-CSF, IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-5, IL-10, INF-γ, IL-8, IL-6,

IL-4) do hãng R&D (Mỹ) sản xuất, bao gồm:

o Khay phản ứng: Đĩa nhựa 96 giếng chuyên dụng có đáy là màng lọc

cho phép các phân tử nhỏ đi qua và hạt nhựa phản ứng có kích thước

8µm được giữ lại.

o Hạt nhựa gắn kháng thể: Hơn hợp chứa tỷ lệ đều nhau của 8 loại hạt

nhựa khác nhau, môi loại hạt nhựa hình cầu đường kính 8µm được gắn

sẵn với kháng thể đơn clơn đặc hiệu với 1 cytokine cần phát hiện.

o Kháng thể phát hiện: Hôn hợp chứa 8 kháng thể đơn clôn đặc hiệu với

8 cytokine kể trên đã gắn Biotin.

o Phức hợp chất huỳnh quang PE gắn Streptavidin.

o Hôn hợp chuẩn chứa 8 cytokine của người cần phát hiện với nồng độ

đã biết.

o Các dung dịch pha mẫu, dung dịch pha sinh phẩm, dung dịch rửa, dung

dịch chạy máy do R&D (Mỹ) sản xuất và cung cấp.



48



Thiết bị phân tích: Hệ thống Luminex 200 và phần mềm điều khiển đi

kèm do hãng Luminex (Mỹ) chế tạo và cài đặt.

- Các bước xét nghiệm:

Bước 1: Chia đều 25l hôn hợp các hạt nhựa đã gắn kháng thể vào các giếng

của khay phản ứng 96 giếng; cho 50l huyết tương hoặc các mẫu cytokine

chuẩn với nồng độ đã biết vào các giếng. Ủ trong điều kiện lắc nhẹ theo vòng

tròn với tốc độ 50 vòng/phút bằng máy lắc trong 30 phút tại nhiệt độ phòng

cho các cytokine trong mẫu xét nghiệm bám vào hạt nhựa thông qua kháng

thể đặc hiệu.

Bước 2: Rửa bằng phương pháp lọc hút qua màng lọc với máy hút chân

không để loại bỏ các thành phần không bám vào hạt, thu được các hạt có gắn

kháng thể và kháng nguyên (cytokin) đặc hiệu.

Bước 3: Cho vào môi giếng 50l kháng thể phát hiện (là hôn hợp kháng thể

đơn clôn kháng các cytokin cần phát hiện đã gắn biotin), ủ tiếp như bước 1 để

kháng thể gắn biotin bám vào kháng nguyên (cytokin) hình thành phức hợp

miễn dịch kiểu sanhdwich trên bề mặt hạt nhựa.

Bước 4: Rửa như bước 2 để thu được các hạt nhựa có phức hợp miễn dịch

kiểu sanhdwich (kháng thể kháng cytokin-cytokin-kháng thể kháng cytokin

gắn biotin) trên bề mặt hạt nhựa.

Bước 5: Cho vào môi giếng 50 l dung dịch cộng hợp Streptavidin-PE và ủ

trong 15 phút như bước 1 cho chất mầu huỳnh quang PE gắn vào phức hợp

miễn dịch thông qua tương tác Biotin-Sreptavidin.

Bước 6: Rửa như bước 2 thu được phức hợp kháng thể-kháng nguyên-kháng

thể-biotin-streptavidin-PE.



49



- Nhận định kết quả cytokine:

Phân tích bằng hệ thống Luminex 200 và phần mềm điều khiển đi kèm

ở chế độ chọn độ nhạy cao. Nồng độ cytokin trong môi mẫu phân tích tỷ lệ

thuận với mật độ huỳnh quang PE của hạt nhựa gắn kháng thể đặc hiệu với

cytokin đó tiết ra. Nồng độ cytokin của mẫu xét nghiệm được tính bằng cách

so sánh mật độ huỳnh quang của mẫu xét nghiệm với mật độ huỳnh quang của

các nồng độ cytokin chuẩn. Đường chuẩn cho môi cytokin được xây dựng độc

lập dựa vào nồng độ đã biết của cytokin đó trong mẫu cytokin chuẩn. Hệ

thống được lập trình phân tích tối thiểu 200 hạt nhựa môi loại (tương ứng với

môi cytokin) để giảm bớt sai sót có thể có do phản ứng miễn dịch diễn ra

không đồng đều giữa các hạt nhựa.



Hình 2.3. Bộ kit xét nghiệm 10 cytokin của Mỹ



50



Hình 2.4. Hệ thống máy Luminex Fluaroanalyzer

2.4. Các bước tiến hành

2.4.1. Chọn bệnh nhân

Tất cả các bệnh nhân mắc VLĐTTCM đến khám khoa khám bệnh và

điều trị nội trú tại Khoa Tiêu hóa và Khoa Khám bệnh Bệnh viện Bạch Mai,

những người đến Bệnh viện bạch Mai khám vì kiểm tra sức khỏe đủ tiêu

chuẩn lựa chọn và không nằm trong tiêu chuẩn loại trừ.

2.4.2. Khám lâm sàng

2.4.2.1. Đối với nhóm bệnh

- Đối tượng nghiên cứu (nhóm bệnh và nhóm chứng) được hỏi bệnh và

khám lâm sàng trực tiếp, tỉ mỉ bởi nghiên cứu sinh. Sử dụng mẫu bệnh án

nghiên cứu thống nhất (phụ lục 2), trong đó ghi đầy đủ các thông tin về tiền

sử, bệnh sử, các dấu hiệu thăm khám lâm sàng.

Bước 1:

- Khai thác tuổi: tuổi của đối tượng nghiên cứu (nhóm bệnh và nhóm

chứng) được tính đến năm tiến hành nghiên cứu, sau đó phân 6 nhóm tuổi

cách nhau môi 10 năm: < 20 tuổi, 20 - 29 tuổi, 30 - 39 tuổi, 40 - 49 tuổi, 50 59 tuổi, và ≥ 60 tuổi.



51



- Khai thác tiền sử của đối tượng nghiên cứu (nhóm bệnh và nhóm

chứng) về tiền sử dùng thuốc, tiền sử mắc các bệnh tự miễn, tiền sử mắc các

bệnh mạn tính.

- Khai thác bệnh sử: đối tượng nghiên cứu (nhóm bệnh và nhóm chứng)

được khai thác đầy đủ thời gian và hồn cảnh khởi phát bệnh, phát hiện có

hay khơng có các triệu chứng cơ năng như đau bụng, phân máu, rối loạn tiêu hóa,...

- Khai thác bệnh sử (thời điểm xuất hiện các triệu chứng và diễn biến

các triệu chứng: đau bụng, phân máu, dây máu,…), khám lâm sàng, làm bệnh

án của nhóm các bệnh nhân thuộc đối tượng nghiên cứu (nhóm bệnh và nhóm

chứng), tất cả được thăm khám đầy đủ, chi tiết theo mẫu bệnh án thống nhất

để xác định các triệu chứng toàn thân, thực thể.

- Thăm khám lâm sàng: đối tượng nghiên cứu (nhóm bệnh và nhóm

chứng) được thăm khám đầy đủ, chi tiết theo mẫu bệnh án thống nhất để xác

định các triệu chứng của bệnh:

+ Bệnh nhân vào viện với các triệu chứng nghi ngờ bệnh VLĐTTCM:

có đại tiện phân máu.

+ Bệnh nhân từ các cơ sở y tế khác chuyển đến với chẩn đốn

VLĐTTCM.

Bước 2:

- Bệnh nhân được nợi soi đại tràng tồn bộ ở tất cả nhóm bệnh đều được

nghiên cứu sinh giải thích kỹ và hợp tác tiến hành nội soi.

2.4.2.2. Đối với nhóm chứng

Bước 1: Lựa chọn nhóm chứng là những người đến bệnh viện khám bệnh vì

kiểm tra sức khỏe.

Bước 2: Được khai thác hỏi kỹ về tiền sử, khám lâm sàng làm các xét nghiệm

công thức máu, CRP, AST, ALT, Ure, Creatinin. Các kết quả trong giới hạn

bình thường.



52



Bước 3: Những người được chọn vào nhóm chứng tiến hành lấy máu sau đó

ly tâm lấy huyết thanh và bảo quản tại khoa Sinh hóa Bệnh viện Bạch Mai

cho đến khi đủ mẫu nghiên cứu. Khi đủ mẫu nghiên cứu tiến hành vận chuyển

mẫu đến Bộ môn Miễn Dịch của Học viện 103 xét nghiệm TNF-α, IL-1β,IL-6,

IL-8,IL-10.

2.5. Nội dung nghiên cứu

2.5.1. Nghiên cứu lâm sàng

- Thời gian từ khi có triệu chứng đầu tiên cho tới khi đến khám bệnh.

- Triệu chứng toàn thân: sốt, sút cân

- Triệu chứng cơ năng: đau bụng, rối loạn phân

+ Đau bụng

+ Rối loạn phân: số lần đại tiện trong ngày, đặc điểm và tính chất phân.

- Triệu chứng ngoài đường tiêu hóa: loét niêm mạc miệng lưỡi, hạch

ngoại biên, đau khớp, vàng da, …

2.5.2. Nghiên cứu huyết học và sinh hóa

* Các xét nghiệm huyết học

- Công thức máu: số lượng hồng cầu, Hb, số lượng bạch cầu.

- Máu lắng 1h

* Các xét nghiệm sinh hóa

- Định lượng CRP

- Định lượng kali

2.5.3. Nghiên cứu miễn dịch

- Xác định nồng độ các globulin miễn dịch toàn phần trong huyết thanh

- Điện di protein huyết thanh bằng phương pháp miễn dịch cố định.

- Xác định nồng độ một số cytokin trong huyết thanh: TNF-α, IL-1β,

IL-6, IL-8, IL-10.

+ So sánh nồng độ TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 huyết thanh ở bệnh

nhân VLĐTTCM với người khỏe mạnh.



53



+ Xác định mối liên quan giữa nồng độ một số cytokinvới đặc điểm

lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân VLĐTTCM.

2.5.4. Nghiên cứu nội soi và mô bệnh học

- Nợi soi đại tràng tồn bợ có sinh thiết: đánh giá vị trí, hình thái và tính

chất của tổn thương.

- Mô bệnh học: đánh giá cấu trúc, đặc điểm viêm mạn, bạch cầu đa

nhân, thay đổi biểu mô, thay đổi phối hợp biểu mô và mức độ viêm.

2.5.5. Các tiêu chuẩn dùng trong nghiên cứu

- Tiêu chuẩn phân loại các giai đoạn hoạt động của bệnh

Bảng 2.3. Phân loại giai đoạn hoạt động bệnh VLĐTTCM trên nội soi

của Baron

Giai đoạn



Hình ảnh



0



Niêm mạc nhạt màu, các mạch máu mỏng mảnh, thưa thớt



I



Niêm mạc lần sần, có các ban đỏ, các mạch máu chỉ nhìn

thấy một phần.



II



Niêm mạc mất nếp ngang, có những ổ loét đặc trưng, không

nhìn thấy mạch, dễ chảy máu khi đèn chạm phải.



III



Niêm mạc phù nề, xung huyết, mủn, có những ổ loét lớn,

chảy máu niêm mạc tự phát là đặc điểm rất quan trọng trong

giai đoạn này.



Bảng 2.4. Tiêu chuẩn phân loại phạm vi tổn thương đại trực tràng theo

phân loại của Montreal - trích dẫn từ tài liệu

Thể bệnh



Phạm vi tổn thương



E1(viêm trực tràng - proctitis)



Tổn thương chỉ ở trực tràng



E2 (viêm loét đại tràng trái left - sided colitis).



Tổn thương từ trực tràng đến đại tràng

góc lách.



E3(viêm lt đại tràng tồn bợ - Tởn thương lan tỏa từ manh tràng đến đại

- Extensive colitis)

tràng góc lách.



54



Bảng 2.5. Tiêu chuẩn đánh giá phân loại mức độ bệnh

VLĐTTCM theo Surtheland

TT



Đặc điểm



0 điểm



1 điểm



2 điểm



1



Tần số đi lỏng



Không



1-2

lần/ngày



2



Chảy máu trực

tràng



Không



Thành vệt Nhìn thấy rõ



3



Hình ảnh niêm

mạc



Bình

thường



4



Đánh giá mức độ

theo thăm khám

lâm sàng



Bình

thường



3 điểm



3-4 lần/ngày > 5lần/ngày

Nhiều



Mủn nhẹ



Niêm mạc

mủn vừa



Niêm mạc rỉ

dịch, chảy

máu



Nhẹ



Vừa



Nặng



Cách tính điểm: < 2 điểm: hồi phục; 3-5 điểm: nhẹ; 6-10 điểm: vừa;

11-12 điểm: nặng.

Bảng 2.6. Tiêu ch̉n chẩn đốn bệnh VLĐTTCM trên mơ bệnh học theo

Nottingham năm 2000 .

Về cấu trúc

Bạch cầu đa nhân

- Không đều, chia nhánh khe tuyến - Trong mô đệm niêm mạc

khu trú

- Khu trú trong biểu mô khe tuyến

- Không đều, chia nhánh khe tuyến - Lan tỏa trong biểu mô khe tuyến

lan tỏa

- Áp xe khe tuyến

- Giảm số lượng khe tuyến/teo

- Dịch rỉ bạch cầu đa nhân

Viêm mạn

Thay đổi biểu mô

- Khu trú hoặc chắp vá

- Bị bào mòn (trợt)/loét

- Tương bào, lympho bào nằm ở - Mất chất mucin

vùng đáy khe tuyến.

- Dị sản tế bào Paneth

- Viêm nông lan tỏa

- Viêm xuyên niêm mạc lan tỏa

- U hạt



Thay đổi phối hợp biểu mô

- Tăng lympho bào nội biểu mô

- Tăng collagen dưới biểu mô



55



Bảng 2.7. Phân loại mức độ hoạt động của viêm trên mô bệnh học theo

Geboes K và CS

Độ hoạt động



Xuất hiện bạch cầu đa nhân trung tính hoặc ái toan



1



- Biểu mô bề mặt



2



- Biểu mô khe tuyến



3



- Biểu mô bề mặt

- Biểu mô khe tuyến



4



- Áp xe khe tuyến



5



- Biểu mô bề mặt

- Áp xe khe tuyến



6



- Biểu mô khe tuyến

- Áp xe khe tuyến



7



- Biểu mô bề mặt

- Biểu mô khe tuyến

- Áp xe khe tuyến



2.6. Xử lý và phân tích số liệu

Số liệu thu thập bằng bệnh án nghiên cứu, được mã hóa, nhập liệu bằng

phần mềm Epidata 3.1. Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê y học,

sử dụng phần mềm SPSS 20. Trong khi xử lý số liệu dùng các thuật toán.

- Sử dụng kiểm định Pearson với cặp biến chuẩn và Spearman với cặp

biến không chuẩn.

- Với các phân phối chuẩn: so sánh trung bình của 2 nhóm độc lập bằng

T-test, so sánh trung bình của 2 nhóm bằng phân tích phương sai anova.

- Với các phân phối không chuẩn so sánh trung vị của 2 nhóm độc lập

bằng kiểm định Mann - Whiney, Anova so sánh trung vị 2 nhóm bằng phân

tích Kruskal - Wallis.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

- Kỹ thuật tiến hành nội soi tại khoa Tiêu hóa và Trung tâm nội soi tiêu hóa Việt Nam - Nhật Bản Bệnh viện Bạch Mai. Qua nội soi các bệnh nhân được sinh thiết niêm mạc tại vùng tổn thương bằng kìm sinh thiết: Auto clave modern FB-24KE của hãng Olympus và

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×