Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
c. Theo dõi hàm lượng

c. Theo dõi hàm lượng

Tải bản đầy đủ - 0trang

Thời gian bảo



Hàm lượng (%) Glipizid/nhãn

Lô 1

Lô 2

Lô 3

quản (tháng)

0 tháng

104,4± 0,31

105,6 ± 0,22

106,1 ± 0,26

1 tháng

103,9±0,29

105,0 ±0,11

105,8±0,18

2 tháng

103,1±0,42

104,4±0,25

105,7±0,24

3 tháng

103,7±0,16

104,8±0,11

105,1±0,15

4 tháng

102,6±0,21

103,5±0,24

104,3±0,34

5 tháng

102,1±0,31

102,9±0,15

103,5±0,29

6 tháng

101,9±0,22

102,0±0,12

103,1±0,27

Kết quả khảo sát hàm lượng của viên bao Glipizid giải phóng kéo dài trong các



điều kiện bảo quản với khoảng thời gian xác định cho thấy: sau 06 tháng bảo quản ở

điều kiện lão hóa cấp tốc và điều kiện thực, sự thay đổi hàm lượng ở các mẫu thử

nghiệm là không đáng kể.

3.7. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VIÊN NÉN GLIPIZID GIẢI

PHÓNG KÉO DÀI

3.7.1. Kết quả đánh giá tương đương hòa tan in vitro so với viên đối chiếu

Tiến hành thử hoà tan giải phóng viên nén bao Glipizid GPKD trong 3 mơi

trường pH 1,2; pH 4,5; pH 6,8 theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.2 và tính tốn giá

trị f2 so với viên chuẩn là Ozidia (phụ lục 2.5). Kết quả được trình bày ở bảng 3.56.

Bảng 3.56. Tỷ lệ % Glipizid giải phóng theo thời gian ở 3 mơi trường pH

(TB± SD, n=12)



D



pH 4,5

9,48



6,96±0,59



8,68



13,63±1,05



7,92



21,79±1,36



4,48



28,15±1,20



6,69



35,52±2,34



2,52



39,71±1,87



3,35



43,14±2,56

57,52

Từ kết quả trong bảng cho thấy, thấy viên nén Glipizid 10 mg giải phóng kéo



123



dài tương đương độ hòa tan in vitro với viên Ozidia ở cả 3 mơi trường hòa tan pH

1,2; 4,5 và pH 6,8. Tất cả các giá trị f2 > 50.

3.7.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Glipizid trong huyết

tương chó

3.6.2.1. Xây dựng phương pháp

- Xử lý mẫu: Mẫu huyết tương được xử lý theo phương pháp chiết lỏng –

lỏng như sau: Lấy 0,5 ml huyết tương (trắng, thử), thêm 50 µl dung dịch chuẩn nội

(dung dịch tolbutamid 5µg/µl), 850 µl HCl 0,05M. Lắc trộn đều. Thêm 5,0 ml

diethyl ether, lắc xốy 3 phút, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy lớp dầu,

bốc hơi dung mơi trong dòng khí N 2 ở 40oC. Hòa tan cắn thu được trong 500 µl

methanol, tiêm 20 µl.

Kết quả chạy mẫu sắc ký cùng điều kiện cho thấy, mẫu sạch, ít tạp, giảm sai

số khi phân tích. Dung mơi chiết sử dụng diethyl ether có nhiệt độ bay hơi thấp, ít

độc, mẫu chiết dược sạch. Vì vậy, phương pháp chiết lỏng-lỏng được lựa chọn.

- Lựa chọn điều kiện sắc ký:

- Cột Comosil C18 (5 àm; 250ì4,6 mm).

- Nhit phõn tớch: nhit phòng.

- Detector UV: 225 nm.

- Thể tích tiêm: 20 µl.

- Pha động: ACN- đệm phosphat pH 3,5 (tỷ lệ thay đổi)

- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

Kết quả khảo sát cho thấy, ở tỷ lệ pha động 54:46, pic nhọn, gọn, cân đối,

thời gian lưu ngắn (Glipizid khoảng 10,2 phút, tolbutamid khoảng 12,8 phút), píc

tách tốt, thời gian phân tích ngắn chỉ khoảng 15 phút.

Mẫu huyết tương trắng: Lấy máu từ tĩnh mạch cổ của chó (khoảng 250 ml),

cho vào ống nghiệm đã tráng heparin. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, tách

lấy huyết tương. Bảo quản trong tủ lạnh sâu -200C.

Mẫu huyết tương thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 100 mg Glipizid (G) và

tolbutamid (T), hòa tan và pha lỗng trong methanol để có nồng độ cuối cùng 10

µg/ml và 5,0 µg/ml tương ứng. Sau đó tiếp tục tiến hành pha loãng trong methanol



124



để đạt nồng độ 50; 200;1000, 2000, 4000, 5000 ng/ml. Lấy 0,5ml các dung dịch

trên, cho bay hơi dung mơi thu được cắn, hòa tan cắn với 0,5ml huyết tương thu

được các mẫu huyết tương thêm chuẩn có nồng độ tương ứng 50; 200;1000, 2000,

4000, 5000 ng/ml.

3.7.2.2. Thẩm định phương pháp

- Độ chọn lọc - đặc hiệu của phương pháp

Tiến hành khảo sát chọn lọc và đặc hiệu của phương pháp, kết quả đươcc̣ trình

bày ở hình 3.24 và bảng 3.57. Kết quả phân tích sắc kí đồ được ở hình 3.22 cho thấy

trên sắc đồ mẫu chuẩn xuất hiện 2 pic được xác định là GLI và TOL(IS); mẫu trắng

khơng có pic tại các vị trí này.

Bảng 3.57. Kiểm tra độ đặc hiệu-chọn lọc của phương pháp

ST

T

1



Diện tích pic mẫu trắng (mAU)

tR từ 12,5 –

tR từ 9,8 – 10,3 phút

13,2phút

-



Tỷ lệ đáp ứng pic

Trắng/GL Trắng/TO

I

L

< 20%

< 5%



2



-



-



< 20%



< 5%



3



689



876



< 20%



< 5%



4



-



-



< 20%



< 5%



5



722



913



< 20%



< 5%



6



-



< 20%

( “-“: khơng có tín hiệu đáp ứng)



< 5%



(a)



5



mAU



10



mAU



10



TOL



GLI



5



0



0

0



2



4



6



8

Minutes



125



10



12



14



15



15



(b)

10



TOL



GLI



5



mAU



mAU



10



5



0



0

0



2



4



6



8



10



12



14



Minutes



15



15



(c)



TOL



GLI



5



mAU



10



mAU



10



5



0



0

0



2



4



6



8



10



12



14



Minutes



20



TOL

10



10



0



0

0



2



4



6



8



10



12



mAU



mAU



(d)



GLI



20



14



Minutes



Hình 3.24. Sắc ký đồ huyết tương trắng(a), huyết tương có chứa chuẩn nội (b),



126



huyết tương có chứa chuẩn và chuẩn nội (c) và huyết tương sau khi chó uống thuốc

2,5 giờ (d)

Kết quả ở bảng 3.54 cho thấy: Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của GLI

(từ 9,8 đến 10,3 phút), đáp ứng pic của mẫu trắng ≤ 20 % diện tích pic của mẫu

chuẩn (diện tích pic trung bình của mẫu chuẩn GLI có nồng độ LLOQ là 27861

mAU). Trong khoảng thời gian lưu từ 12,5 đến 13,2 phút, diện tích pic mẫu trắng ≤

5% diện tích pic chuẩn nội(diện tích pic Tol; trung bình là 139634 mAU.s ở bảng

3.47). Như vậy, phương pháp phân tích đảm bảo nhận diện, phân biệt được GLI với

chuẩn nộiTol và không bị ảnh hưởng bởi các tạp chất có trong huyết tương, có độ

chọn lọc đạt yêu cầu.

- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính



Tiến hành pha các mẫu huyết tương chứa chuẩn Glipizid có nồng độ khoảng

từ 50 - 5000 ng/ml. Phân tích theo quy trình đã xây dựng. Xác định mối tương

quan giữa nồng độ Glipizid trong huyết tương và tỷ lệ diện tích pic GLI/TOL.

Kết quả xác định mối tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic của GLI/TOL với nồng

độ của GLI trong huyết tương chó được trình bày trong bảng 3.58 và hình 3.23.

Bảng 3.58. Mối tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic của GLI/TOL với nồng độ

của GLI trong huyết tương chó

Nồng

Diện tích pic

độ

(mAu)

(ng/ml

)

Glipizid TOL

50

27861 13963

200

69513 143264

1000



333989



2000



696200



4000



1497966



5000



1584969



tỷ lệ

GLI/TO

Phương trình hồi

L

Độ đúng qui

0,199529

85,1%

0,485216



89,3%



152852 2,184963

165568 4,204919

172988 8,659364



98,8%



155398 10,19988

1



127



97,5%

101,8%

96,1%



y = 0,0021x 0,1102

R² = 0,9984



Hình 3.25. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic GLI/TOL

với nồng độ Glipizid

Kết quả trên cho thấy: Trong khoảng nồng độ từ 50ng đến 5000 ng/ml, có sự

tương quan tuyến tính giữa nồng độ GLI và tỷ lệ diện tích pic GLI/TOL với hệ số

tương quan R2≈ 1. Nồng độ GLI xác định từ đường chuẩn so với giá trị thực đều đạt

85,1 – 101,8 % và nằm trong giới hạn cho phép (80 – 120 %) đối với nồng độ thấp

nhất và 85 - 115 % cho các nồng độ còn lại).

- Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)



Phân tích các mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trong khoảng

tuyến tính (50 ng/ml). Xác định đáp ứng pic của mẫu chuẩn và mẫu trắng. Tính

nồng độ GLI trong mẫu chuẩn từ diện tích pic GLI và đường chuẩn. Từ đó, xác

định độ đúng bằng cách so sánh với giá trị thực có trong mẫu. Kết quả xác định giá

trị LLOQ của phương pháp được trình bày ở bảng 3.55.

Kết quả ở bảng 3.56 cho thấy: Đáp ứng của mẫu chuẩn tại khoảng thời gian

lưu của GLI (nồng độ 50 ng/ml) cao gấp trên 5 lần đáp ứng mẫu trắng. Các nồng độ

tìm thấy so với giá trị thực đạt từ 89,8% đến 112,2 % (nằm trong khoảng 80 – 120

%) và độ lặp lại sau 6 lần phân tích RSD < 10 %). Như vậy, mẫu chứa GLI có nồng

độ 50 ng/ml đáp ứng yêu cầu là giới hạn định lượng dưới của phương pháp phân

tích dịch sinh học.



128



Bảng 3.59. Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

SĐ N Đ

Tá ồ ộ

Tp n đ

1> 5 1

51

2> 4 8

4 9,

3> 4 9

8 6,

4> 4 9

7 5,

5> 5 1

40

6> 5 1

Tr 6 11

0

Ru 9,

S khác

7 ngày

- Độ đúng - độ lặp lại trong ngày và

Pha các mẫu LQC (200 µg/ml), MQC (1000ng/ml) và HQC (4000ng/ml).

Tiến hành xử lý mẫu và phân tích sắc ký theo các điều kiện đã lựa chọn. Xác định

nồng độ GLI có trong mẫu bằng phương pháp đường chuẩn và tỷ lệ (% ) giữa nồng

độ xác định được từ đường chuẩn so với nồng độ lý thuyết. Kết quả xác định độ

đúng, lặp lại trong ngày và khác ngày của phương pháp được trình bày ở bảng 3.60.

Bảng 3.60. Khảo sát độ đúng và độ lặp lại trong ngày và khác ngày (n = 6)

Thống nhất /pp

Ngày

1

2

I



II



Mẫu LQC

(200ng/ml)

Nồng độ

Độ đúng

(ng/ml)

(%)

203

101,7

194

97,1



Mẫu MQC

(2000ng/ml)

Nồng độ

Độ đúng

(ng/ml)

(%)

2133

106,7

1968

98,4



Mẫu HQC

(4000ng/ml)

Nồng độ Độ đúng

(ng/ml)

(%)

3844

96,1

3566

89,2



3



217



108,6



2085



104,3



4367



109,2



4



206



102,9



2160



108,0



4355



108,9



5



216



108,3



1841



92,1



3648



91,2



6



205



102,4



2239



112,0



3577



89,4



1



196



98,0



2115



105,8



3616



90,4



2



202



100,9



2035



101,8



3651



91,3



3

4



186



93,2



1975



98,8



3764



94,1



220



110,1



2009



100,5



3612



90,3



129



II

I



5



186



88,3



1881



94,1



4270



106,8



6



222



110,9



2210



110,5



4140



103,5



1



189



94,6



1987



99,4



3811



95,3



2



211



105,5



2022



101,1



4082



102,1



3



182



91,2



1975



98,8



3933



98,3



4



191



95,7



1972



98,6



4255



106,4



5



199



99,8



2017



100,9



4259



106,5



6



205



102,6



1965



98,3



3942



98,6



TB (%)



100,9



101,4



98,2



7,2

RSD (%)

6,1

4,8

Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại trong ngày và khác ngày ở bảng 3.57



cho thấy: Ở cả ba nồng độ (LQC (200 ng/ml), MQC (2000 ng/ml) và HQC

(4000ng/ml)), phương pháp đều cho độ đúng cao, dao động từ 89,2 đến 110,5 %,

độ lệch chuẩn tương đối nằm trong giới hạn cho phép từ 85-115 %; độ lặp lại trong

ngày với giá trị RSD nhỏ (4,85 – 7,20 %). Như vậy, phương pháp phân tích đạt yêu

cầu về độ đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

♦ Xác định độ tìm lại của phương pháp

Xác định tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn và chuẩn nội bằng cách so sánh diện tích

pic của GLI và IS từ mẫu huyết tương với diện tích pic của chúng trong mẫu pha

động có chứa cùng nồng độ. Kết quả xác định tỷ lệ thu hồi GLI và IS được trình

bày ở bảng 3.61.

Bảng 3.61. Tỷ lệ thu hồi của GLI và IS của phương pháp



GLI

98190

99778

99430

98859

98734

96355



130



974634

996109

938438

977087

985381

917407



1952379

1942910

1953783

1833977

1904585

1916214



Kết quả phân tích cho thấy, phương pháp có tỷ lệ thu hồi GLI và IS cao và lặp

lại. Hiệu suất thu hồi GLI ở các khoảng nồng độ thấp, trung bình, cao đều đạt từ 80,792,4% với RSD < 10%. Hiệu suất thu hồi của chuẩn nội đạt 80,0- 90,7% (RSD <

10%).

♦ Độ ổn định trong quá trình xử lý mẫu

Đánh giá độ ổn định trong quá trình xử lý mẫu trên các mẫu LQC và HQC. So

sánh nồng độ GLI trong các mẫu LQC và HQC sau khi pha được xử lý theo quy

trình đã lựa chọn và các mẫu LQC và HQC có cùng nồng độ tương ứng nhưng xử lý

sau khi để rã đơng ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ. Kết quả đánh giá độ ổn định được

trình bày ở bảng 3.62:

Bảng 3.62. Kết quả độ ổn định mẫu trong quá trình xử lý

Mẫu LQC (200 ng/ml)



Mẫu HQC (4000 ng/ml)



STT



Nồng độ ban

đầu (ng/ml)



Nồng độ sau 4

giờ (ng/ml)



Nồng độ ban

đầu (ng/ml)



Nồng độ sau 4

giờ (ng/ml)



1

2

3

4

5



205,6

208,5

217,3

212,0

207,5



201,6

192,9

205,6

193,1

207,2



3899,9

4060,4

4032,0

3848,3

3599,0



3694,6

3893,1

4003,8

4046,0

3980,3



131



6

TB

RSD (%)



202,4

208,9

2,48



193,1

198,9

3,38



3794,1

3872,3

4,37



3940,0

3926,3

3,19



Kết quả phân tích cho thấy, nồng độ GLI trong mẫu LQC và HQC được xử lý

ngay và sau 4 giờ để tan chảy ở nhiệt độ phòng khác nhau không đáng kể (RSD <

5%). Như vậy mẫu phân tích ổn định trong q trình xử lý mẫu.

♦ Độ ổn định dài ngày

Đánh giá độ ổn định mẫu huyết tương LQC và HQC. Xác định nồng độ GLI có

trong mẫu tại các thời điểm ngay sau khi chuẩn bị và sau 10, 20, 30 ngày bảo quản ở

nhiệt độ -200C theo phương pháp đã xây dựng. Kết quả được trình bày bảng 3.63:

Bảng 3.63. Kết quả độ ổn định mẫu dài ngày



ml)

Thông số thống kê



132



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

c. Theo dõi hàm lượng

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×