Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
- Kỹ thuật tiến hành nội soi tại khoa Tiêu hóa, Khoa Thăm dò chức năng và Trung tâm nội soi tiêu hóa Việt Nam - Nhật Bản Bệnh viện Bạch Mai. Qua nội soi các bệnh nhân được sinh thiết niêm mạc tại vùng tổn thương bằng kìm sinh thiết: Auto clave modern FB-2

- Kỹ thuật tiến hành nội soi tại khoa Tiêu hóa, Khoa Thăm dò chức năng và Trung tâm nội soi tiêu hóa Việt Nam - Nhật Bản Bệnh viện Bạch Mai. Qua nội soi các bệnh nhân được sinh thiết niêm mạc tại vùng tổn thương bằng kìm sinh thiết: Auto clave modern FB-2

Tải bản đầy đủ - 0trang

46



- Dụng cụ nội soi:

+ Máy nội soi: Sử dụng máy nợi soi cửa sở thẳng tại khoa tiêu hố và khoa

Thăm dò chức năng Bệnh viện Bạch Mai.

+ Kìm sinh thiết: Auto clave modern FB-24KE của hãng Olympus.

+ Dung dịch cố định bệnh phẩm: Formol 10%.

+ Tiêu bản

- Chuẩn bị bệnh nhân trước khi nội soi:

+ Chế độ ăn: Ngừng tất cả các thuốc điều trị chứa sắt trước 3-4 ngày soi

Và không ăn thức ăn có chất xơ trước 1 ngày

+ Làm sạch đại tràng:

Bệnh nhân uống 3 gói thuốc Fortrant pha trong 3 lít nước lọc, uống hết

trong vòng 3 giờ và uống trước khi tới soi: 6 giờ

- Thực hành kỹ thuật nội soi và sinh thiết

+ Giải thích để bệnh nhân yên tâm phối hợp với thầy thuốc.

+ Bệnh nhân nằm ngửa hoặc nghiêng trái, hai chân co ép vào bụng.

+ Quan sát vùng hậu môn và thăm trực tràng bằng tay.

Sau khi đã bôi trơn máy soi bằng mỡ Lidocain (K-Y), đưa ống soi qua

hậu môn vào trong lòng đại tràng. Khi không rõ đường cần bơm hơi vừa

phải. Soi từng đoạn từ trực tràng đến đại tràng sigma đến đại tràng góc lách

 đại tràng ngang  đại tràng góc gan  đại tràng lên  manh tràng, van

bauhin và đoạn cuối hồi tràng. Vừa từ từ đẩy máy vừa quan sát sơ bộ rồi

quan sát kỹ vùng tổn thương đánh giá theo tiêu chí theo phân loại giai đoạn

hoạt động bệnh của Baron và định khu tổn thương đại tràng như sau:

+ Viêm loét trực tràng (proctitis): tổn thương chỉ ở trực tràng.

+ Viêm loét trực tràng và đại tràng sigma (distal colitis): tổn thương ở trực

tràng đến giữa đại tràng sigma (khoảng 60 cm với ống soi đại tràng mềm).



47



+ Viêm đại tràng trái (left - sided colitis): từ trực tràng lên đến đại

tràng góc lách nhưng không bao gồm đại tràng góc lách.

+ Viêm đại tràng phải (extensive colitis): từ trực tràng lên tới ĐT

góc gan, không bao gồm manh tràng

+ Viêm đại tràng tồn bợ (pancolitis): gồm cả manh tràng đại tràng bình

thường VLĐTTCM mức độ nhẹ.

Trong kỹ thuật soi chúng tôi soi kiểm tra đến hồi tràng ở tất cả các

bệnh nhân để loại trừ bệnh Crohn.

Kỹ thuật sinh thiết làm mô bệnh học:

Vị trí sinh thiết: là vùng tổn thương của đại trực tràng. Sinh thiết ít nhất

03 mảnh ở các vị trí khác nhau.

Mẫu bệnh phẩm (Tissue sampling) sau khi sinh thiết đều để chung

trong 1 lọ bảo quản bằng Formol 10% và chuyển đến Trung tâm Giải phẫu bệnh

- Bệnh viện Bạch Mai.

+ Mô bệnh học: được tiến hành tại Trung tâm Giải phẫu bệnh Bệnh viện

Bạch Mai. Sau khi thu thập mẫu bệnh phẩm đảm bảo về số lượng mảnh sinh

thiết và bảo quản đúng quy trình. Bệnh phẩm được nhuộm kỹ thuật HE và PAS.

Sử dụng kính hiển vi quang học Nikon ở các độ phóng đại khác nhau (40, 100

và 200 lần) để quan sát tổn thương. Kết quả được đánh giá theo tiêu chuẩn

Nottingham 2000 bởi các chuyên gia đầu ngành mơ bệnh học.

- Sau khi bệnh nhân được chẩn đốn VLĐTTCM trên lâm sàng và nội

soi tiến hành lấy máu làm các xét nghiệm công thức máu, máu lắng, CRPhs,

albumin, điện giải đồ, globulin miễn dịch, điện di protein và các cytokine. Lấy

máu tĩnh mạch được tiến hành trên 78 bệnh nhân (nhóm bệnh) và 30 người đến

khám vì kiểm tra sức khỏe (nhóm chứng). Thời điểm lấy máu là trước 9 giờ sáng,

chưa ăn sáng. Trước đó chưa được dùng thuốc điều trị nào hoặc dùng chế phẩm

nào ức chế miễn dịch.



48



+ Các xét nghiệm huyết học: lấy 1 ml máu, bơm nhẹ máu vào thành

ống nghiệm có chống đông bằng EDTA không để sủi bọt và tránh vỡ hồng cầu,

đậy chặt nắp tuýp, lắc nhẹ 2 phút để chống đông nhưng không gây vỡ hồng cầu.

Lắc đều khoảng 2 phút trước khi phân tích và được tiến hành tại khoa huyết học

Bệnh viện Bạch Mai, thực hiện trên máy XT - 400 của Sysmexa.

+ Các xét nghiệm sinh hóa: lấy 2 ml máu, bơm nhẹ máu vào thành

ống nghiệm không để sủi bọt và tránh vỡ hồng cầu, đậy chặt nắp tuýp, lắc nhẹ

2 phút để máu trộn đều với heparin, mẫu được gửi tới Khoa Sinh hóa Bệnh

viện Bạch Mai để xét nghiệm định lượng globulin huyết thanh trên hệ thống

máy sinh hóa - miễn dịch Cobas 8000 của hãng Roche.

+ Xét nghiệm điện di protein huyết thanh: lấy 3 ml máu, bơm nhẹ máu

vào thành ống nghiệm bằng thủy tinh không có chống đông, không để sủi bọt và

tránh vỡ hồng cầu, đậy chặt nắp tuýp và chuyển đến Khoa Huyết học được xét

nghiệm bằng phương pháp miễn dịch cố định tiến hành tại khoa Huyết học

Bệnh viện Bạch Mai trên máy Hydrasys 2 scan của Sebia (Pháp).



Hình 2.3. Máy điện di protein Hydrasys 2 scan của Sebia

+ Xét nghiệm TNF-α, IL-1β,IL-6, IL-8,IL-10 trong huyết thanh: Lấy

2ml máu vào ống nghiệm không có thuốc chống đông sau đó ly tâm tách lấy

huyết thanh để xét nghiệm.



49



Bước 3: Lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu khi có đủ tiêu chuẩn chẩn đốn

VLĐTTCM, bệnh nhân khơng tḥc nhóm có các tiêu chuẩn loại trừ của

nghiên cứu.

Bước 4: Ly tâm mẫu 20 phút với tốc độ 3000 vòng/phút, tách huyết tương.

Loại bỏ các mẫu bị đông, vẩn đục và có nhiều váng lipid. Huyết thanh được

đựng vào ống eppendorf có ghi mã số, lưu giữ huyết thanh ở tủ lạnh âm sâu

700C tại Khoa Sinh hóa Bệnh viện Bạch Mai cho đến khi đủ số lượng mẫu,

mang ra phân tích tại Bộ môn Miễn dịch - Học viện Quân Y.

2.3.2.2. Đối với nhóm bệnh

Bước 1: Lựa chọn nhóm chứng là những người đến bệnh viện khám bệnh vì

kiểm tra sức khỏe.

Bước 2: Bệnh nhân được khai thác hỏi kỹ về tiền sử, khám lâm sàng làm các

xét nghiệm công thức máu, CRP, AST, ALT, Ure, Creatinin. Các kết quả trong

giới hạn bình thường.

Bước 3: Bệnh nhân chọn vào nhóm chứng được lấy máu sau đó ly tâm lấy

huyết thanh và bảo quản tại khoa Sinh hóa Bệnh viện Bạch Mai cho

ddeenskhi đủ mẫu nghiên cứu. Khi đủ mẫu nghiên cứu tiến hành vận chuyển

mẫu đến Bộ môn Miễn Dịch của Học viện 103 xét nghiệm TNF-α, IL-1β,IL6, IL-8,IL-10.

2.4. Nội dung nghiên cứu

2.4.1. Nghiên cứu lâm sàng

- Thời gian từ khi có triệu chứng đầu tiên cho tới khi đến khám bệnh.

- Triệu chứng toàn thân: sốt, sút cân

- Triệu chứng cơ năng: đau bụng, rối loạn phân

+ Đau bụng

+ Rối loạn phân: số lần đại tiện trong ngày, đặc điểm và tính chất phân.

- Triệu chứng ngoài đường tiêu hóa: loét niêm mạc miệng lưỡi, hạch

ngoại biên, đau khớp, vàng da, …



50



2.4.2. Nghiên cứu huyết học và sinh hóa

* Các xét nghiệm huyết học

- Công thức máu: số lượng hồng cầu, Hb, số lượng bạch cầu chung.

- Máu lắng 1h

* Các xét nghiệm sinh hóa

- Định lượng CRP

- Định lượng kali

2.4.3. Nghiên cứu miễn dịch

- Xác định nồng độ các globulin miễn dịch toàn phần trong huyết thanh

- Điện di protein huyết thanh bằng phương pháp miễn dịch cố định.

- Xác định nồng độ một số cytokine trong huyết thanh: TNF-α, IL-1β,

IL-6, IL-8, IL-10.

+ So sánh nồng độ một số cytokine huyết thanh ở bệnh nhân

VLĐTTCM với người khỏe mạnh.

+ Xác định mối liên quan giữa nồng độ một số cytokinevới đặc điểm

lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân VLĐTTCM.

2.4.4. Nghiên cứu nội soi và mô bệnh học

- Nợi soi đại tràng tồn bợ có sinh thiết: đánh giá vị trí, hình thái và tính

chất của tổn thương.

- Mô bệnh học: đánh giá cấu trúc, đặc điểm viêm mạn, bạch cầu đa

nhân, thay đổi biểu mô và thay đổi phối hợp biểu mô.

2.5. Các chỉ tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu lâm sàng:

- Tuổi: tính theo năm và chia làm 6 nhóm tuổi: < 20; 20 - 29; 30 - 39; 4049, 50-59 và ≥ 60.

- Giới tính: nam, nữ



51



- Thời gian mắc bệnh: < 1 năm, 1 - 5 năm, 6 -10 năm, > 10 năm.

- Các triệu chứng toàn thân:

+ Sốt: chia 3 mức theo Robert C. Langan (nhẹ: không sốt, vừa: sốt

3702 - 3708, nặng: sốt > 3708).

+ Sút cân: dựa vào mức độ sút cân tính theo trọng lượng cơ thể của

Robert C. Langan chia 3 mức (nhẹ: không sút cân, vừa: sút cân 1-10%, nặng:

sút cân > 10%).

+ Đại tiện phân máu nhiều lần trong ngày. Rối loạn phân. Tính chất

phân bao gồm: lỏng lẫn nhày, dây máu, máu đỏ tươi, máu đỏ thẫm.

+ Số lần đại tiện: được chia 3 mức độ theo Robert C. Langan (nhẹ: < 4

lần/ ngày; vừa: 4 - 6 lần/ ngày; nặng: > 6 lần/ ngày) .

+ Mức độ mất máu: chúng tôi chia làm 3 mức là nhẹ, vừa và nặng

Nhẹ: Hb từ 90 - < 120 g/l

Vừa: Hb từ 60 - < 90 g/l

Nặng: Hb dưới 60 g/l

+ Phân loại mức độ bệnh: chia 3 mức độ nhẹ, vừa và nặng dựa theo

tiêu chí phân loại của Sutherland .

Nghiên cứu huyết học và sinh hóa:

* Các xét nghiệm huyết học

Các xét nghiệm huyết học được tiến hành tại khoa huyết học Bệnh viện

Bạch Mai, thực hiện trên máy XT - 400 của Sysmexa.

- Công thức máu: dựa vào phân loại mức độ mất máu chúng tôi chia

các mức giảm đối với hồng cầu, Hb.

+ Hồng cầu chia bình thường và 2 mức giảm (> 3 x 10 12/l; 2,5 - 3 x

1012/l và < 2,5 x 1012/l).

+ Hb: chia bình thường và 3 mức giảm (nhẹ: Hb từ 90 - < 120 g/l,

vừa: Hb từ 60 - < 90 g/l, nặng: Hb dưới 60 g/l).



52



+ Số lượng bạch cầu chung: dựa vào giá trị bình thường , chia 2 mức

tăng và bình thường (>15 G/l, >10 - 15 G/l và ≤ 10 G/l).

- Máu lắng 1giờ: chia mức tăng và bình thường (>20 mm/h và ≤ 20 mm/h).

* Các xét nghiệm sinh hóa

Các xét nghiệm sinh hóa được tiến hành tại khoa Sinh hóa Bệnh viện

Bạch Mai trên hệ thống máy sinh hóa - miễn dịch Cobas 8000 của hãng Roche.

- CRP: chia mức tăng và bình thường (> 1 mg/dl và  1 mg/dl).

- Kali: dựa vào giá trị bình thường chúng tôi chia kali mức

bình thường và 2 mức giảm (≥ 3,5 mmol/L, 2,6 - 3,4 mmol/L và ≤

2,5mmol/L).

Nghiên cứu miễn dịch:

- Xét nghiệm điện di protein huyết thanh.

Dựa vào giá trị bình thường của các phần protein khi điện di , chúng tôi

chia các mức như sau:

Bảng 2.4. Các mức thành phần protein khi điện di

Các phần protein (%)

Mức

Bình thường

Giảm

Tăng



α1



α2



β



γ



2 - 3,5

<2

> 3,5



5,4 - 10,6

< 5,4

> 10,6



7 - 14

<7

> 14



8 - 18

<8

> 18



- Xét nghiệm các globulin miễn dịch toàn phần trong huyết thanh. Giá

trị bình thường được sử dụng chuẩn hóa theo máy xét nghiệm chia bình

thường và tăng như sau:

Bảng 2.5. Các mức globulin miễn dịch



53



Globulin



IgA(mg/dL)



IgG(mg/dL)



Bình thường



≤ 400



≤ 1600



≤ 230



< 100



Tăng



> 400



> 1600



> 230



≥ 100



Mức



IgM(mg/dL) IgE(U/ml)



- Xét nghiệm định lượng nồng độ TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10.

Nghiên cứu nội soi và mô bệnh học:

- Nợi soi đại tràng tồn bợ: đánh giá vị trí, hình thái, tính chất tổn

thương và phân loại giai đoạn hoạt động theo Baron.

- Mô bệnh học: được đánh giá theo tiêu chuẩn Nottingham 2000 .

- Phân loại mức độ viêm trên mô bệnh học, chúng tôi chia 7 độ, trong

đó độ 1,2 và 3 là mức độ nhẹ; 4,5,6, và 7 là mức độ nặng :

Bảng 2.6. Độ hoạt động của viêm trên mô bệnh học

Độ hoạt động Sự xuất hiện bạch cầu đa nhân trung tính hoặc ưa toan

1



- Biểu mô bề mặt



2



- Biểu mô khe tuyến



3



- Biểu mô bề mặt

- Biểu mô khe tuyến



4



- Áp xe khe tuyến



5



- Biểu mô bề mặt

- Áp xe khe tuyến



6



- Biểu mô khe tuyến

- Áp xe khe tuyến



- Biểu mô bề mặt

7

- Biểu mô khe tuyến

- Áp xe khe tuyến

Nghiên cứu TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10



54



Xét nghiệm định lượng nồng độ TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 trong

huyết thanh tiến hành sau khi thu thập đủ số lượng mẫu huyết thanh nghiên

cứu và thực hiện xét nghiệm tại bộ môn Miễn Dịch của Học viện Quân Y.

Các TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 được phân tích bằng phương pháp

miễn dịch huỳnh quang sử dụng công nghệ xét nghiệm miễn dịch dựa trên

nền tảng



kỹ



thuật



phân tích



dòng



chảy



(Flowcytometry-assisted



immunoassay) trên hệ thống Luminex 200 và phần mềm điều khiển đi kèm do

hãng Luminex (Mỹ) chế tạo và cài đặt với sinh phẩm đồng bộ do R&D (Mỹ)

cung cấp. Kết quả được phân tích bởi Tiến sĩ Đô Khắc Đại - Phó bộ môn

Miễn dịch.

- Sinh phẩm xét nghiệm: Bộ sinh phẩm phát hiện đồng thời 9 cytokine

của người (gồm GM-CSF, IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-5, IL-10, INF-γ, IL-8, IL-6,

IL-4) do hãng R&D (Mỹ) sản xuất, bao gồm:

o Khay phản ứng: Đĩa nhựa 96 giếng chuyên dụng có đáy là màng lọc

cho phép các phân tử nhỏ đi qua và hạt nhựa phản ứng có kích thước

8µm được giữ lại.

o Hạt nhựa gắn kháng thể: Hôn hợp chứa tỷ lệ đều nhau của 8 loại hạt

nhựa khác nhau, mơi loại hạt nhựa hình cầu đường kính 8µm được gắn

sẵn với kháng thể đơn clôn đặc hiệu với 1 cytokine cần phát hiện.

o Kháng thể phát hiện: Hôn hợp chứa 8 kháng thể đơn clôn đặc hiệu với

8 cytokine kể trên đã gắn Biotin.

o Phức hợp chất huỳnh quang PE gắn Streptavidin.

o Hôn hợp chuẩn chứa 8 cytokine của người cần phát hiện với nồng độ

đã biết.

o Các dung dịch pha mẫu, dung dịch pha sinh phẩm, dung dịch rửa, dung

dịch chạy máy do R&D (Mỹ) sản xuất và cung cấp.



55



Thiết bị phân tích: Hệ thống Luminex 200 và phần mềm điều khiển đi

kèm do hãng Luminex (Mỹ) chế tạo và cài đặt.

- Các bước xét nghiệm:

Bước 1: Chia đều 25l hôn hợp các hạt nhựa đã gắn kháng thể vào các giếng

của khay phản ứng 96 giếng; cho 50l huyết tương hoặc các mẫu cytokine

chuẩn với nồng độ đã biết vào các giếng. Ủ trong điều kiện lắc nhẹ theo vòng

tròn với tốc độ 50 vòng/phút bằng máy lắc trong 30 phút tại nhiệt độ phòng

cho các cytokine trong mẫu xét nghiệm bám vào hạt nhựa thông qua kháng

thể đặc hiệu.

Bước 2: Rửa bằng phương pháp lọc hút qua màng lọc với máy hút chân

không để loại bỏ các thành phần không bám vào hạt, thu được các hạt có gắn

kháng thể và kháng nguyên (cytokine) đặc hiệu.

Bước 3: Cho vào môi giếng 50l kháng thể phát hiện (là hôn hợp kháng thể

đơn clôn kháng các cytokine cần phát hiện đã gắn biotin), ủ tiếp như bước 1

để kháng thể gắn biotin bám vào kháng nguyên (cytokine) hình thành phức

hợp miễn dịch kiểu sanhdwich trên bề mặt hạt nhựa.

Bước 4: Rửa như bước 2 để thu được các hạt nhựa có phức hợp miễn dịch

kiểu sanhdwich (kháng thể kháng cytokine-cytokine-kháng thể kháng

cytokine gắn biotin) trên bề mặt hạt nhựa.

Bước 5: Cho vào môi giếng 50 l dung dịch cộng hợp Streptavidin-PE và ủ

trong 15 phút như bước 1 cho chất mầu huỳnh quang PE gắn vào phức hợp

miễn dịch thông qua tương tác Biotin-Sreptavidin.

Bước 6: Rửa như bước 2 thu được phức hợp kháng thể-kháng nguyên-kháng

thể-biotin-streptavidin-PE.



56



- Nhận định kết quả cytokine:

Phân tích bằng hệ thống Luminex 200 và phần mềm điều khiển đi kèm

ở chế độ chọn độ nhạy cao. Nồng độ cytokine trong môi mẫu phân tích tỷ lệ

thuận với mật độ huỳnh quang PE của hạt nhựa gắn kháng thể đặc hiệu với

cytokine đó tiết ra. Nồng độ cytokine của mẫu xét nghiệm được tính bằng

cách so sánh mật độ huỳnh quang của mẫu xét nghiệm với mật độ huỳnh

quang của các nồng độ cytokine chuẩn. Đường chuẩn cho môi cytokine được

xây dựng độc lập dựa vào nồng độ đã biết của cytokine đó trong mẫu cytokine

chuẩn. Hệ thống được lập trình phân tích tối thiểu 200 hạt nhựa môi loại

(tương ứng với môi cytokine) để giảm bớt sai sót có thể có do phản ứng miễn

dịch diễn ra không đồng đều giữa các hạt nhựa.



Hình 2.4. Bộ kit xét nghiệm 10 cytokine của Mỹ



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

- Kỹ thuật tiến hành nội soi tại khoa Tiêu hóa, Khoa Thăm dò chức năng và Trung tâm nội soi tiêu hóa Việt Nam - Nhật Bản Bệnh viện Bạch Mai. Qua nội soi các bệnh nhân được sinh thiết niêm mạc tại vùng tổn thương bằng kìm sinh thiết: Auto clave modern FB-2

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×