Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
b. Đột biến ribosome mục tiêu

b. Đột biến ribosome mục tiêu

Tải bản đầy đủ - 0trang

Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Trong lựa chọn in vitro của Escherichia coli đột biến ribosome được đánh giá cao trong

việc đề kháng với Erythromycin. Dimethyl hóa một nucleotide của rRNA 23S bởi methyl

transferase loại erm. Cơ chế này chịu trách nhiệm phần lớn trong việc kháng Clarithromycin ở

các chủng vi khuẩn Mycobacterium avium và Helicobacter pylori. Đột biến tương tự cũng đã

được báo cáo trong Treponema pallidum và các loài Propionibacterium.

Đột biến trong protein ribosome L4 và L22 tạo ra sự kháng Erythromycin đã được ghi

nhận trong phòng thí nghiệm và phân lập lâm sàng của S.pneumoniae. Những thay đởi tạo

thành nhóm trong một chuỗi bảo tồn cao của L4 và tạo tính kháng Macrolide nhưng khơng

kháng Clindamycin. Mặc dù các loại đề kháng được coi là khơng thể chuyển nhượng, nhưng

phế cầu (S.pneumococci) có thể có được gen kháng kháng sinh bằng gen bên ngoài chuyển

vào bằng cách chuyển đởi sau đó tái tở hợp tương đồng, do đógen kháng kháng sinh có thể lây

lan.

Qua trung gian peptit: Có thể đ̉i thuốc ra khỏi vị trí liên kết với ribosom, từ đó sự tách

ra của peptidyl-tRNA bị ức chế do tương tác của chuỗi peptit đặc hiệu mới tạo thành với thuốc

kháng sinh, và quá trình tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn vẫn tiếp tục.

1.3.1.4.2



Cơ chế bơm thuốc ra (efflux pumps)



2.4.32.2.Cơ chế bơm thuốc ra (efflux)

Các vi khuẩn có khả năng bơm các phân tử của thuốc kháng sinh ra khỏi tế bào khi thuốc

xâm nhập vào nguyên sinh chất qua các kênh porin trên thành tế bào trước khi thuốc đến được

chỗ ribosome.

Trong vi khuẩn gram âm, các bơm được mã hóa trong nhiễm sắc thể góp phần vào sự

kháng nội tại với các hợp chất kỵ nước, chẳng hạn như các Macrolide. Trong vi khuẩn gram

dương, kháng Macrolide bằng cơ chế bơm thuốc ra ngoài này là do 2 loại máy bơm ATPbinding-cassette (ABC)và Major-facilitator-superfamily (MFS).

Cho đến nay, các protein tham gia q trình đẩy thuốc ra ngồi tạo khả năng đề kháng

Macrolide đặc trưng cho loài Staphylococccus là vận chuyển ABC được mã hóa bởi gen

plasmidborne msr(A). Gen msr(A) ban đầu được phát hiện trong Staphylococcus epidermidis,

và kể từ đó, nó đã được tìm thấy trong một loạt các lồi tụ cầu (Staphylococcal), bao gồm

S.aureus. Vận chuyển ABC yêu cầu ATP để hoạt động và thường được hình thành bởi một

kênh bao gồm 2 kênh xuyên màng và 2 ATP-binding nằm ở bề mặt của cytosolic màng.

Gen msr(A) mã hóa một protein với 2 ATP-binding đặc trưng cho vận chuyển ABC. Bản

chất thành phần màng của bơm msr(A) vẫn chưa được biết. Hệ thống này có thể có nhiều

thành phần, liên quan đến gen msr(A) và nhiễm sắc thể để tạo thành một máy bơm hoạt động



8



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



đầy đủ đặc trưng cho Macrolide14 - và 15-cạnh và B Streptogramin (MSB).Erythromycin và

macrolid 14 - và 15-cạnh khác là chất gây cảm ứng, trong khi Streptogramin B thì khơng. Do

đó, chủng đề kháng với Streptogramin B chỉ sau khi cảm ứng với Erythromycin.

Gen msr(A) khơng được tìm thấy trong liên cầu khuẩn (Streptococci). Trong chi

Streptococcus, gen mef(A) mã hóa một máy bơm, mà có thể được tìm thấy trong phân lập lâm

sàng của S. pneumoniae và S. pyogenes, trong các loài khác của liên cầu khuẩn (liên cầu

khuẩn miệng, liên cầu khuẩn nhóm C và G, và Streptococcus agalactiae), và trong vi khuẩn

ruột. Các gen mef(A) ban đầu đã được báo cáo trong S.pyogenes. Một gen tương tự, từng được

gọi là mef(E), nhưng bây giờphân loại lại như mef(A), đã được báo cáo sau trong S.

pneumoniae. proteinmef(A) thuộc về MFS. Các protein này được thúc đẩy bởi động cơ proton

và chỉ ảnh hưởng đến Macrolide vòng 14 - và 15-cạnh (kiểu hình M).

Các gen mef(A) có thể có được bằng cách kết hợp S. pyogenes và S. pneumoniae và được

sinh ra bởi transposon trong S. pneumoniae. Sự kết hợp củaerm(B) và mef(A) gen có thể được

tìm thấy trong S. pneumoniae, S. pyogenes, hoặc S. Aga- lactiae. Các chủng này có một kiểu

hình MLSB.

2.4.32.3. Sự ngưng hoạt đợng của thuốc:

Gắn liền với cơ chế này của kháng kháng sinh, và không giống như sửa đổi mục tiêu, làm

bất hoạt kháng sinh đề kháng đối với thuốc kháng sinh chỉ có liên quan về mặt cấu trúc.

Esterases và transferases phospho được báo cáo trong enterobacteria kháng Erythromycin và

Macrolide 14- và 15-cạnh khác. Các enzyme này được vi khuẩn tổng hợp để phân cắt kháng

sinh hoặc tác dụng lên một phần trong cấu trúc của kháng sinh làm bất hoạt chúng.

2.5.



Vancomycin-Glycopeptit:

2.5.1. Tổng quan[2, 3]:



Kháng sinh glycopeptide rất quan trọng để điều trị các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng do

vi khuẩn gram dương gây ra bao gồm Staphylococci, Streptococci , Enterococci , và

Clostridia.

Trong nhóm glycopeptides, vancomycin là kháng sinh được sử dụng phở biến nhất, ngồi

ra còn có teicoplanin. Vancomycin được phát hiện vào đầu những năm 1950, như một sản

phẩm trao đổi thứ cấp được sản xuất bởi các vi khuẩn đất Streptomyces orientalis (nay đổi tên

thành Amycolatopsis orientalis ) , vancomycin nhanh chóng được đưa vào sử dụng lâm sàng



9



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



cho điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gram dương mà khơng có đáp ứng với các tác

nhân kháng khuẩn có sẵn .

Vancomycin có tác dụng tốt trên các vi khuẩn gram dương hiếu khí và kỵ khí, bao gồm :

tụ cầu (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis) (kể cả các chủng kháng

methicilin không đồng nhất), liên cầu khuẩn (gồm có Streptococcus pneumoniae (kể cả chủng

đã kháng penicilin), Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus bovis),

cầu tràng khuẩn (ví dụ Enterococcus faecalis) và Clostridiae. Vancomycin có tác dụng in vitro

trên các vi khuẩn: Listeria monocytogenes, Lactobacillus spp., Actinomyces spp., Clostridium

spp. và Bacillus spp.

2.5.2.



Cấu trúc và cơ chế tác động:



Cấu trúc:



Vancomycin là một thành viên của họ kháng sinh glycopeptide có vài chục thành viên.

Các kháng sinh này bao gồm một trong hai cấu trúc heptapeptide mạch thẳng cốt lõi mà lần

lượt được sửa đởi bởi glycosyl hóa chọn lọc và sự sửa đổi acid amin tạo ra các hợp chất khác

nhau.



10



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Bên cạnh các axit amin thường được tìm thấy trong các protein như Asn và Leu, các

glycopeptide cũng kết hợp axit amin bất thường bao gồm 3,5-dihydroxyphenylglycine

(DHPG), beta-hydroxytyrosine (beta-OHTyr), và p-hydroxyphenylglycine (HPG). Ngồi việc

liên kết thơng qua các liên kết peptide, các axit amin thơm cũng có thể được tham gia vào qua

các liên kết chéo thông qua carboncarbon thơm hoặc liên kết ether giữa axit amin 2 và 4, 4 và

6, và 5 và 7. Hai thuốc kháng sinh glycopeptide được sử dụng lâm sàng, vancomycin và

Teicoplanin, cũng đáp ứng như nguyên mẫu với các cấu trúc lõi heptapeptide.

Cả hai sự bảo toàn tetrapeptide đầu cuối-C bao gồm (HOOC)-DHPG-(beta-OHTyr) HPG-HPG-(NH2). Các cấu trúc lõi sau đó phân ra trong tripeptide đầu cuối-N với lớp

vancomycin bao gồm (HOOC)-Asn-beta-OHTyr-Leu-(NH2), và lớp teicoplanin là (HOOC)HPG-beta-OHTyr-HPG-(NH2).

Sự đa dạng trong các cấu trúc lõi này đạt được thơng qua biến đởi hóa học của các axit

amin, ví dụ, sự xử lí bằng clo của beta-OHTyr, N-methyl hóa của Lue, sunfuric hóa của HPG,

và thơng qua glycosyl hóa có chọn lọc, phở biến nhất tại trung tâm HPG và beta-OHTyr áp

chót, mà còn ở DHPG C- đầu cuối và HPG N- đầu cuối của các kháng sinh với lõi teicoplanin.

Glycosyl hóa thêm vào của các dư lượng carbohydrate có thể xảy ra, như có thể thay thế các

đường bằng các nhóm acyl béo như trong teicoplanin (Hình 1). Lớp Teicoplanin của

glycopeptide cũng có thể được chia thành các hợp chất mà axit amin 1 (HPG) và 3 (DHPG) là

liên kết ngang, ví dụ như, teicoplanin, và có nơi khơng có, ví dụ như, avoparcin.

-



Cơ chế tác đợng của thuốc:





Thơng qua sự ức chế các bước ngoại bào trong sinh tổng hợp peptidoglycan.



Trong cấu trúc màng vi khuẩn gram dương, hệ thống Peptidoglycan với các đơn vị cấu tạo

là N-acetylmuramic acid (NAM) và N -acetylglucosamine (NAG) peptide đóng vai trò kiến

tạo quan trọng. Vancomycin ức chế q trình liên kết của các thành phần này vào cấu trúc

màng do đó ức chế q trình hình thành màng tế bào vi khuẩn. Đây chính là cơ chế tác động

chính của kháng sinh Vancomycin.

Sự ức chế enzyme transglycosylase dẫn đến ngăn cản một cách hiệu quả sự phát triển

và lắp ráp của các chuỗi peptidoglycan.





11



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Ngồi ra Vancomycin còn làm thay đởi tính thấm màng tế bào và sự sinh tổng hợp ARN

của vi khuẩn.



2.5.3.



Kháng Glycopeptit:



Kháng glycopeptide trong Enterococci thể hiện trong ít nhất là sáu kiểu hình riêng biệt

phân loại dựa trên sự nhạy cảm, bề rộng của sự kháng với các hợp chất riêng lẽ, và mức độ

kháng. Sáu kiểu hình đó bao gồm: VanA, VanB, VanC, VanD, VanF, VanG. Mỗi cụm gen Van

cho thấy gen liên kết với kiểu hình đề kháng cụ thể :



12



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án cơng nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Hình 5: Cụm gen van kháng kháng sinh Glycopeptide

Mỗi kiểu hình tương ứng với các kiểu gen nhất định, nồng độ kháng tương ứng và đặc

trưng cho các chủng Enterococci khác nhau. Sau đây là bảng nồng độ ức chế tối thiểu các kiểu

gen của 2 loại Glycopeptide là Vancomycin và Teicoplanin [2]

Bảng nồng độ ức chế tối thiểu các kiểu gen của Vancomycin [2]

Kiểu hình



VanA (thường

trong commonly in

E. faecalis và and

E. faecium)

VanB



Kiểu gen



Kháng



Kháng



Vancomycin



Teicoplanin



High-level

Cụm gene

vanA gene

cluster

Cụm gene



resistanceKháng mức caoHigh-level

cao

resistance MICMIC-64 μg/mL16–512 μ/mL

≥1000 μg/mL

Kháng mức



(commonly



vanB gene



caoHigh-level



inthường ở E.



cluster



resistance MIC-4–512



faecalis và and E.



Kháng mức



μg/mL



Sensitive

Nhạy cảm

MIC≤

0.5μg/mL



Loại kháng



High level

inducible

resistanceKháng

cảm ứng mức cao

Kháng cảm

ứng mức caoHigh

level inducible

resistance



faecium)

VanC (E.



Các cụm



gallinarum, E.



gen vanC1,



casseliflavus , E.



vanC2, vanC3



flavescens)



gene clusters



Low level



Sensitiv Nhạy



resistance Kháng mức cảme

MIC≤

thấp

MIC-2μg/mL-32 0.5μg/mL



Low level

constitutive

resistanceKháng

cấu mức thấp



μg/mL

Kháng mức caoCụm gene

VanD



vanD gene

cluster



Low-level

Inducible



trung bìnhModerate-



resistance Kháng



High level resistance

MIC-64–256



mức thấp MIC-4–



resistanc Kháng



32 μg/mL



cảm ứnge



μg/mL

VanE



Cụm gene

vanE gene

cluster



Kháng mức

thấpLow-level



SensitiveNhạy

cảm



resistance MIC-16



Kháng cảm

ứngInducible



MIC-≤0.5



resistance



13



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



μg/mL

VanG



gene vanG

gene



VanL



Cụm gene

vanL gene

cluster



μg/mL



Low level



Sensitiv Nhạy



resistanceKháng mức cảme

MIC≤

thấp

MIC ≤ 16μg/mL 0.5μg/mL

Kháng mức thấp

Low level



Sensitiv Nhạe



Kháng cảm

ứngInducible

resistance

Kháng cảm

ứngInducible



resistance MIC-8



resistance



μ/mL

Kháng mức

VanM



vanM



caoHigh-level

resistance

MIC>256μg/mL



High level

resistance Kháng



ứngInducible



mức cao



resistance



Kháng mức thấp

Low-level

VanN



vanN



Kháng cảm



resistance MIC-16



Sensitive

MIC

0.5μg/mL



Constitutive

resistanceKháng



cấu

μg/mL

Cơ chế cơ bản của kháng Vancomycin trong Enterococci là sự hình thành của các thụ

thể Peptidoglycan với giảm ái lực glycopeptide. Điều này dẫn đến giảm liên kết của

Vancomycin và giảm ức chế tổng hợp thành tế bào. Tiền chất Peptidoglycan với giảm ràng

buộc với Vancomycin chịu trách nhiệm cho việc này. Thay vì các Peptidoglycan tiền thân

thường xảy ra D- alanine - Dalanine , tiền thân như D- ala -D- lactate hoặc D- ala -D- serine

được tìm thấy trên các vách tế bào của chủng kháng Vancomycin của vi khuẩn ruột. D- ala -Dlactate đã được tìm thấy có một mối quan hệ ít hơn D- ala -D- ala 1000 lần đối với

Vancomycin trong khi D- ala -D- serine có một mối quan hệ về ít hơn tiền thân tế bào bình

thường 6 lần . Điều đó đã được chỉ ra rằng việc thay thế các đầu cuối D- alanine của thành tế

bào di động với kết quả D- lactate trong lực đẩy trong chuỗi liên kết của các phân tử

Vancomycin dẫn đến làm giảm 1000 lần trong mối quan hệ với các kháng sinh. Thay thế D- ala

- Dserine kết quả giảm 6 lần trong mối liên hệ với Vancomycin vì nhóm hydroxymethyl của

serine là cồng kềnh hơn so với nhóm methyl của alanine.



14



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Chương 2: Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh

2.1. Kỹ



thuật PCR:



2.1.1. Giới thiệu chung:

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh

năm 1985.

Kĩ thuật PCR ( polymerase chain reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme

polymerase ) lLà phương pháp in vitro để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó, có độ nhạy

rất cao mà chỉ cần một lượng mẫu ban đầu hạn chế, được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt

( máy PCR ).

Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: trong y học, vi sinh vật học,

công nghệ sinh học… Trong công nghệ sinh học, PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ

gen, phát hiện gen, dòng hố gen, giải mã trình tự ADN…

2.1.2. Phản ứng PCR:

a. Nguyên lý:

PCR là phương pháp tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn trên cơ

sở hoạt động invitro của enzyme DNA polymerase để tổng hợp các sợi mới bổ

sung cho các sợi DNA khuôn. Đây là một phản ứng dây chuyền nhân bản DNA

diễn ra trong điều kiện invitro

Phản ứng PCR xảy ra bên ngồi tế bào. Kỹ thuật tởng hợp ADN ngồi cơ thể cũng tuân thủ

theo những nguyên tắc cơ bản của quá trình sao chép ADN trong cơ thể như: cần sự mở xoắn

thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi ( mồi xuôi, mồi ngược ), cần nguyên liệu và mơi trường

thích hợp, và cần có sự tham gia của enzyme ADN polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có

khác là dùng nhiệt cao (940C) tháo xoắn thay cho helicase keeta hợp cho từng giai đoạn phản



15



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế. Nhờ kỹ thuật PCR mà với một lượng nhỏ

ADN ban đầu chúng ta có thể thu được lượng AND đủ lớn cần thiết để tiến hành các thí

nghiệm về AND.







Các thành phần của một phản ứng PCR:

Muốn tiến hành phản ứng PCR cần phải có các thành phần sau:

- AND khuôn

- Mồi

- ADN polymerase (thường dùng Taq polymerase)

- Các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

- Dung dịch đệm (buffer: nồng độ Mg2+)

c. Chu kỳ nhiệt:

Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:

Biến tính (denaturation): Trong giai đoạn biến tính, phân tử ADN khn mẫu ở dạng xoắn kép







được tách thành 2 sợi đơn. Q trình biến tính thường được thực hiện ở khoảng 94 0C trong

vòng 30 giây – 1 phút.

Bắt cặp mồi(annealing): Trong giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi)







cho phép các mồi bắt cặp với khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Nhiệt độ này dao động trong

khoảng 40-650C, tùy thuộc vào Tm của mồi sử dụng.

Kéo dài (extension): Giai đoạn này nhiệt độ được tăng lên đến 70-72 0C. Đây là khoảng nhiệt



b.



độ tối thích cho Taq polymerase hoạt động, tiến hành tởng hợp ADN bắt đầu từ vị trí có mồi

theo chiều 5’-3’. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần nhân bản.

• Phản ứng PCR sẽ quay vòng 3 bước kể trên nhiều lần.



16



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

b. Đột biến ribosome mục tiêu

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×