Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Chương 2: Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh

Chương 2: Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh

Tải bản đầy đủ - 0trang

Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế. Nhờ kỹ thuật PCR mà với một lượng nhỏ

ADN ban đầu chúng ta có thể thu được lượng AND đủ lớn cần thiết để tiến hành các thí

nghiệm về AND.







Các thành phần của một phản ứng PCR:

Muốn tiến hành phản ứng PCR cần phải có các thành phần sau:

- AND khn

- Mồi

- ADN polymerase (thường dùng Taq polymerase)

- Các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

- Dung dịch đệm (buffer: nồng độ Mg2+)

c. Chu kỳ nhiệt:

Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:

Biến tính (denaturation): Trong giai đoạn biến tính, phân tử ADN khn mẫu ở dạng xoắn kép







được tách thành 2 sợi đơn. Q trình biến tính thường được thực hiện ở khoảng 94 0C trong

vòng 30 giây – 1 phút.

Bắt cặp mồi(annealing): Trong giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi)







cho phép các mồi bắt cặp với khn theo nguyên tắc bổ sung. Nhiệt độ này dao động trong

khoảng 40-650C, tùy thuộc vào Tm của mồi sử dụng.

Kéo dài (extension): Giai đoạn này nhiệt độ được tăng lên đến 70-72 0C. Đây là khoảng nhiệt



b.



độ tối thích cho Taq polymerase hoạt động, tiến hành tổng hợp ADN bắt đầu từ vị trí có mồi

theo chiều 5’-3’. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần nhân bản.

• Phản ứng PCR sẽ quay vòng 3 bước kể trên nhiều lần.



16



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Hình 2.1: Sơ đồ phản ứng PCR

Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR điển hình thường là:

* Gây biến tính ADN: 94-950C, 30s-1phút

* Gắn mồi: khoảng 600C, 30s

* Kéo dài: 720C, 1 phút



17



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án cơng nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Hình 2.2: Chu kỳ nhiệt

2.1.3. Các loại phản ứng PCR:

Có 3 loại phản ứng PCR như sau: Standard PCR là phản ứn PCR có một mồi.

Phản ứng multiplex PCR : là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông thường, ở đó hai

hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng (tương ứng có hai mồi

trở lên).

Standard PCR: có một mồi

PCR kết hợp enzyme cắt hạn chế :( AFLP) sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen

thành, sử dụng những phân đoạn DNA làm khn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể

dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen.

2.2.



Thiết lập mợt phản ứng phát hiện gen kháng kháng sinh:



Các phản ứng PCR khác nhau ở DNA khuôn, mồi và chu kỳ nhiệt. Vì vậy để thiết lập

được một phản ứng PCR cho kết quả mong đợi ta cần khảo sát các điều kiện tối ưu cho phản

ứng





Xác định DNA nguồn: cần xác định việc biểu hiện kiểu hình của vi sinh vật

mang gen cần xác định có thể bằng phương pháp D test, ta sẽ có thể phát



18



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



hiện được vi sinh vật đó đã mang gen kháng thuốc chưa trước khi xác định

gen kháng thuốc.





Chọn mồi: mỗi loại mồi chỉ thích hợp cho một hoặc vài locus nhất định.

Việc chưa phát hiện được gen kháng thuốc đó như thế nào sẽ gây khó khăn

cho việc lựa chọn mồi. Vì vậy có thể lựa chọn phương pháp multiplex PCR,

chồng chéo các mồi trong một phản ứng để đạt hiệu quả cao hơn. Sau khi đã

định hình được đoạn gen kháng thuốc thì ta sẽ lựa chọn đoạn mồi phù hợp

để đạt hiệu quả cao hơn.







Kết hợp enzyme cắt hạn chế: với những DNA có kích thước lớn thì sẽ kết

hợp enzyme cắt hạn chế để hiệu quả tháo xoắn cao hơn.







Chu kỳ nhiệt: với mỗi phản ứng có một chu kỳ nhiệt tối thích, quyết định kết

quả phản ứng. Nhiệt độ gắn mồi thường phụ thuộc vào %GC, chiều dài mồi,

độ phù hợp của mồi…



Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm) được ước lượng qua một số công thức sau:

+ Nếu chiều dài DNA < 14 base và nồng độ ion M + ở điều kiện tiêu

chuẩn (50mM) thì:

Tm (0C) = 4 × (G + C) + 2 × (A + T)

+ Nếu chiều dài sợi DNA lớn hơn và cũng điều kiện ion tiêu chuẩn

trên thì: Tm (0C) = 64.90C + 410C ×(G + C – 16.4) / N. Với N là chiều dài sợi DNA tương

hợp.

+Nếu nồng độ muối thay đổi so với điều kiện trên , ta dùng cơng

thức:

Tm (0C) = 81.50C +16.60C × log10([Na+] +[K+]) + 0.410C × (%GC) – 675/N





Multiplex PCR đối với gen kháng kháng sinh:



19



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thơng thường, ở đó

hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng. Từ các mơ

tả đầu tiên về nó thì phương pháp này đã từng được áp dụng thành công trong rất

nhiều lĩnh vực thí nghiệm ADN gồm có phân tích mất đoạn, đột biến, đa hình hoặc

trong các phương pháp định lượng

Thí nghiệm tiến hành trên lồi Streptogramin

PCR được thực hiện trong tởng khối lượng 25 µl có chứa 4 µl dung dịch mẫu,

0.4 mM (mỗi) mồi, và 1.25U GoTaq DNA polymerase (Promega, Madison, WI). Tất cả

các phản ứng được thực hiện trong một Perkin-Elmer GeneAmp Hệ thống PCR 2400

(Perkin-Elmer, MA) theo các điều kiện sau: ban đầu biến tính (94o C, 5 phút), 30 chu

kỳ (94o C, 30s), ủ (nhiệt độ thích hợp, 1 phút), và kéo dài (72o C, 1 phút) tiếp theo là

một phần mở rộng cuối cùng (72o C, 7 phút). Điện di 10 µl sản phẩm PCR thực hiện

trên agarose gel 1,5% chứa 0,5 µl ethidium bromide và theo dõi bằng tia cực tím. Các

chủng sau đây đã được phát hiện trong phản ứng PCR: E. faecium ATCC 51.559

(VanA và Soda), E. faecalis ATCC 51.299 (vanB, sodA, agg, CPD, và Gele), và E.

faecium CVM 3001 và 3002 cho vatE và vatD.







Multiplex PCR đối với gen kháng kháng sinh macrolide:

-



Quy trình làm tương tự như Vancomycin



20



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



-



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Mồi được sử dụng đố với các chủng khác nhau:



1.Chủng MANNHEIMIA HAEMOLYTICA và PASTEURELLA MULTOCIDA [9]



2.Cho chủng Streptococcus [6]



3.cho các chủng Streptococcus, Enterococcus, Corynebacterium, and Pseudomonas [8]



21



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



2.3.



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Kỹ thuật PCR xác định gen kháng kháng sinh đối với loài Streptococcus pneumoniea:



Sơ đồ xác định loại kháng sinh kháng Streptococcus pneumoniea:



22



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Lấy mẫu



Nuôi cấy và phân lập



Nuôi tăng sinh trong môi trường chứa kháng sinh



Chọn lọc ra các loại kháng sinh kháng Streptococcus pneumoniea



Xác định kiểu gen kháng kháng sinh

Xác định kiểu hình kháng kháng sinh



23



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



Tùy theo mỗi loại bệnh phẩm mà ta sử dụng các thủ thuật lấy mẫu, cách nuôi cấy và phân lập

vi khuẩn khác nhau. Ở đây ta xét với loại bệnh phẩm là máu. Vi khuẩn được phân lập từ máu

của bệnh nhân viêm màng não, viêm phởi cấp

2.2.1



Lấy mẫu:



Trong tường hợp bệnh nhân có sốt cao, nghi viêm màng não, viêm phổi cấp, dùng bơm

kim tiêm vơ khuẩn lấy ít nhất 3ml máu tĩnh mạch cho ngay vào bình canh thang não-tim

(brainheart infusion) hay thioglycolate theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang, hoặc sử

dụng chai cấy máu do các hãng thương mại pha chế sẵn.

Chú ý: Động tác và quá trình lấy máu, cấy máu phải đảm bảo thật vô khuẩn trong một quy

trình kín. Tốt nhất kim lấy máu được nối trực tiếp vào bình mơi trường qua một ống cao su

hay plastic vơ khuẩn. sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn iot.

2.2.2



Nuôi cấy và phân lập [4, 5]:



+ Phế cầu khuẩn cũng là một vi khuẩn rất nhạy cảm và dễ chết, vì vậy tốt nhất các

bệnh phẩm nên được chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2h, hoặc khơng q 6h, và có

thể giữ ở nhiệt độ 4-80C trong vòng 24h. nếu q trình ln chuyển bệnh phẩm từ 2-4h thì

bệnh phẩm có thể được cấy ngay hoặc tăng sinh trước trong canh thang (tryptocasein soya

24



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



hoặc canh thang não-tim) 2h ở 370C. Nếu thời gian chuyển bệnh phẩm từ 4-8h, bệnh phẩm nên

được ủ trong canh thang ít nhất là 2h rồi mới sang thạch máu 5%.

+ Một số môi trường ni cấy phát hiện phế cầu khuẩn:





Thạch máu 5% có Gentamycin [5µg/ml]: mơi trường này chỉ cho phế

cầu khuẩn phát triển.







Thạch máu 5% % khơng có Gentamycin: tìm phế cầu, liên cầu, tụ cầu

và một số trực khuẩn gram âm.







Thạch máu thỏ 7% phát hiện cả phế cầu và H.influenzae.



 Mơi trường đặc hiệu để phát hiện Streptococcus pneumoniea đó là: mơi trường

thạch máu 5% Gentamycin [5µg/ml]

Ủ trong điều kiện mơi trường 37 0C, có 5%CO2 từ 18-24h. Nếu khơng có tủ ấm CO2,

đặt các hộp lồng vào chng thủy tinh kín và đốt 1 ngọn nến, khi nến tắt cũng tạo được khí

trường có CO2, sau đó đặt chng vào tủ ấm 370C  Sau 18-24h, quan sát trên môi trường

thạch máu thấy các khuẩn lạc của phế cầu khuẩn nhỏ 0.5-1.5 mm, có vỏ nhày ướt, có xu

hướng lõm giữa, có quầng tan huyết màu xanh (kiểu tan huyết α)  cấy thuần lại trên một đĩa

thạch máu khác, ủ ấm ở 370C/ 5% CO2 trong 18h. Ngày tiếp theo, làm thêm các thử nghiệm

sau để khẳng định (nếu chỉ thấy một loại khuẩn lạc thì khơng cần cấy thuần mà có thể làm

ln các bước khẳng định).

Các thử nghiệm xác định:



-







Thử nghiệm Optochin (nhạy cảm với optochin)







Thử nghiệm tan trong muối mật (Bile solubility)







Thử nghiệm ngưng kết trên phiến kính



Tiêu chuẩn chẩn đốn xác định vi khuẩn Streptococcus pneumoniae [6]:

+ Hình thể khuẩn lạc trên mơi trường thạch máu 5% (có hay khơng có gentamycin):trò



n,



25



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Đồ án công nghệ 1



GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú



nhỏ, dẹt, khơng màu, và có xu hướng lõm ở giữa (nhưng có ‘đỉnh’ khi quan sát sớm hơn 14 gi

ờ nuôi cấy),môi trường nuôi cấy xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết α.

+ Hình thể vi khuẩn: hình lưỡi mác hay ngọn nến, nối đơi giống hình cặp kính, cũng có

thể đứng đơn hay tạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương (xanh tím) nhưng phải.

+ Nhạy cảm optochin: đường kính vòng vơ khuẩn ≥ 14mm.

Hoặc: ít nhạy cảm với optochin (đường kính vòng vơ khuẩn 9-13mm) nhưng tan trong

muối mật cũng kết luận là phế cầu khuẩn.

2.2.3



Nuôi tăng sinh trong môi trường chứa kháng sinh:



Nuôi tăng sinh để xác định khả năng kháng kháng sinh của Streptococcus pneumoniea:

ta tiến hành nuôi trong môi trường BHIA (brain-heart infusion agar) thạch máu 5% có chứa

Gentamycin và đồng thời bổ sung thêm kháng sinh (erythromycin và penicilin)  đo vòng vơ

khuẩn  sàng lọc được các loại kháng sinh kháng Streptococcus pneumoniae pneumoniae

kháng kháng sinh.( đó là: penicillin và Macrolide).

Chú ý: Cchủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae sẽ không phát triển được trong

điều kiện:

+ Môi trường thạch máu không đảm bảo chất lượng (máu lỗng ít hồng cầu, để lâu, lỗ

mỏng).

+ Bảo quản bệnh phẩm không đúng cách. Bệnh phẩm để lâu mới xử lý.

2.2.4



Cách xác định kiểu hình kháng kháng sinh của chủng Streptococcus

pneumoniae:



Sau khi đã sàng lọc được loại kháng sinh kháng Streptococcus pneumoniae (penicillin

và Macrolide) thì ta tiến hành xác định kiểu hình kháng sinh.

Ở đây ta thí nghiệm với kháng sinh Erythromycin và Clindamycin

Có 2 cách để xác định kiểu hình kháng kháng sinh đó là:





Kĩ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán.



26



SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Chương 2: Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×