Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

13



Sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel pha thường thì hợp chất khơng (kém) phân

cực được giải ly ra khỏi cột trước, còn hợp chất phân cực giải ly ra sau. Với hai chất

khơng phân cực, chất có trọng lượng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn bị giữ

lại trong cột lâu hơn chất còn lại.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký cột trung áp. Sử

dụng máy bơm hút dung môi từ bình chứa đẩy vào đầu cột, từ đó đẩy chất ra khỏi cột

nhờ áp lực của bơm trung áp. Có thể điều chỉnh tốc độ dòng chảy của dung môi nhờ

van điều chỉnh của máy bơm [3], [10].

2.2.2 Phương pháp đánh giá cảm quan thành phần tạo mùi hương

Đánh giá cảm quan là kỹ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để

nhận biết, mô tả và định lượng các tính chất cảm quan của một sản phẩm như màu sắc,

hình thái, mùi vị và cấu trúc.

Để đánh giá cảm quan các thành phần tạo mùi hương chúng tôi sử dụng phép

thử cho điểm. Phép thử này thường dùng để xác định xem mức độ khác nhau về một

tích chất cảm quan nào đó giữa nhiều mẫu là bao nhiêu. Trong nghiên cứu này, phép

thử được dùng để xác định xem nhóm thành phần tạo hương có mùi thơm giống mùi

của tinh dầu trầm hương hay không.

Trước tiên người thử sẽ được làm quen để xác định mùi hương của mẫu. Giai

đoạn tiếp theo người thử sẽ nhận được đồng thời tất cả các mẫu cần đánh giá. Những

người này thường là các chuyên gia cảm quan, đã có thời gian dài được huấn luyện và

làm việc trong lĩnh vực này. Sau khi ngửi thử, người thử sẽ đánh giá cường độ của tính

chất cảm quan của mỗi mẫu thông qua một điểm số tương ứng với một thuật ngữ mơ tả

cường độ của tính chất ấy đã được quy định sẵn. Thang điểm thường dùng trong phép

thử này là thang 6 điểm. Thang điểm hay thuật ngữ mơ tả là do người điều hành thí

nghiệm lựa chọn, tuy nhiên cần tránh những thuật ngữ không rõ nghĩa [4].



14



2.2.3 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) là sự kết hợp hai kỹ thuật để tạo thành một

phương pháp duy nhất trong phân tích hỗn hợp các chất. Hai thiết bị này có khả năng

bổ sung và hỗ trợ cho nhau trong q trình phân tích, sắc ký khí tách các thành phần

của một hỗn hợp và khối phổ phân tích đặc tính của từng thành phần riêng lẻ đó. Như

vậy, khi tiêm mẫu vào hệ thống sẽ tách ra các thành phần riêng biệt từ hỗn hợp các chất

và xác định từng thành phần trong chúng. Hơn nữa, nó còn có khả năng xác định được

hàm lượng của từng thành phần.

Thiết bị GC-MS được cấu tạo gồm hai phần: phần sắc ký khí (GC) và phần khối

phổ (MS):

- Sắc ký khí (GC) dùng để chia tách hỗn hợp chất ra các thành phần riêng lẻ,

mỗi thành phần có một giá trị riêng biệt. Trong sắc ký khí sự chia tách xuất hiện khi

mẫu được bơm vào pha động. Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, mỗi hợp

chất trong hỗn hợp mẫu tương tác với pha tĩnh một lực tương tác khác nhau, hợp chất

tương tác yếu sẽ thoát ra khỏi cột trước. Hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi

sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hay áp suất của pha động. Pha động là một khí trơ

như heli, pha tĩnh được sử dụng là hóa chất và được chứa trong cột. Cột GC được làm

bằng thủy tinh, inox hay thép khơng gỉ có kích thước rất đa dạng. Chiều dài thường lớn

hơn 25m và đường kính rất nhỏ như một ống mao dẫn. Một chất chia tách, rửa giải

phóng đi ra khỏi cột và đi vào đầu dò. Đầu dò có khả năng tạo ra một tín hiệu khi phát

hiện ra chất cần phân tích. Tín hiệu này phát ra từ máy tính, thời gian từ khi bơm mẫu

đến khi rửa giải gọi là thời gian lưu (tR). Nếu trong cùng điều kiện sắc ký như nhiệt độ,

loại cột…giống nhau thì cùng một chất ln có cùng thời gian lưu. Trong q trình

chạy sắc ký, máy tính sẽ tạo ra một đồ thị từ các tín hiệu gọi là sắc ký đồ. Mỗi peak

trong sắc ký đồ đại diện cho một tín hiệu được tạo ra khi một chất rửa giải từ cột sắc ký

đi vào đầu dò detector. Trục hoành biểu thị thời gian lưu (tR), trục tung biểu thị cường



15



độ của tín hiệu. Mỗi đỉnh peak biễu diễn một chất riêng lẻ và có thời gian lưu tương

ứng.

- Khối phổ (MS) dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó.

Khi giải hấp các chất riêng lẻ ở pha khí từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện

ion hóa (mass spectrometry) và bị vỡ thành những mãnh vụn là các vật mang điện (ion)

rồi đi vào đầu dò detector. Máy tính sẽ ghi lại biểu đồ sau mỗi lần quét. Trục hoành

biễu diễn tỉ lệ m/z (tương ứng với khối lượng phân tử mỗi mãnh) còn trục tung biễu

diễn cường độ tín hiệu của mỗi mảnh vụn được quét bởi đầu dò detector. Biểu đồ này

gọi là khối phổ. Khối phổ MS này được đem so sánh với các khối phổ MS chuẩn có

trong thư viện khối phổ đã được xác định trước. Việc này giúp ta có thể định danh

được chất đó [11].



16



CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM

3.1 HĨA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ

3.1.1 Hóa chất

Dung mơi dùng để chạy cột: n-hexane, ethyl acetate.

Dung mơi dùng để phân tích GC-MS: n-hexane, acetone.

Silicagel cỡ hạt 40 – 60 µm được sử dụng cho pha thường.

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ

3.1.2.1) Thiết bị

Thiết bị GC-MS GC-MS Scion 456-GC/Scion SQ.



Hình 3.5 Thiết bị GC-MS Scion 456-GC/Scion SQ.

Máy bơm và máy phân đoạn hứng tự động.

Máy cơ quay chân khơng Buchi.

Cân phân tích.

Máy đánh siêu âm Sonicator.



17



Máy thổi khí nitơ N2 LCMS.

3.1.2.2) Dụng cụ

Cột sắc ký đường kính 1,7 cm.

Dụng cụ dùng để hứng phân đoạn: hủ bi 20mL.

Dụng cụ chứa mẫu phân tích: Vial 1,5 mL.

Bình cầu cơ quay.

Một số dụng cụ khác: bình chứa dung mơi, pipet định mức, pipet paster, phễu

thủy tinh, ống đong, erlen...

3.2 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TINH DẦU TRẦM HƯƠNG

BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS

3.2.1 Công đoạn chuẩn bị mẫu

Mẫu được chuẩn bị bằng cách hòa tan 10µL tinh dầu Trầm hương trong 990µL

n- hexane và 200 µL acetone cho vào một vial.



Hình 3.6 Mẫu tinh dầu Trầm hương phân tích GC-MS.



18



3.2.2 Cơng đoạn phân tích GC-MS

Thành phần hóa học của tinh dầu trầm hương xác định bằng phương pháp phân

tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) được thực hiện tại Viện hàn lâm khoa học và

công nghệ Việt Nam (Số 1, Mạc Đĩnh Chi, P. Bến Nghé, Q.1, Tp.HCM).

Phân tích GC-MS được tiến hành trên máy Scion 456-GC/Scion SQ (Scion

Instrument, Hoa Kỳ) với cột sắc ký khí RESTEK (dài 30m; đường kính 0,25mm; phim

dày 0,25m) cùng phần mềm điều khiển MS Workstation 8. Các điều kiện phân tích

cho GC-MS là được liệt kê trong bảng 2.1.

Bảng 3.2.2.1.a.1 Các điều kiện để phân tích cho GC-MS

Chương trình

Điều kiện

Nhiệt độ ban đầu: giữ ở 100oC trong vòng 1 phút.

Giai đoạn 1: tăng 15oC/phút cho đến 140oC thì giữ 20

Chương trình nhiệt



phút.

Giai đoạn 2: tăng 10oC/phút tới 230oC.

Giai đoạn 3: tăng 25oC/phút tới 280oC.



Khí mang

Tốc độ dòng

Thể tích mẫu tiêm

Nhiệt độ buồng tiêm

Năng lượng ion hóa

Ghi nhận khối phổ m/z



Heli

1 mL/phút

1µL

250oC

70 eV

Trong khoảng 50-500 amu



Việc định danh các thành phần trong tinh dầu được thực hiện bằng cách so sánh

phổ của từng cấu tử tách ra trên sắc ký đồ với các phổ chuẩn có trong thư viện phổ

NIST MS Search 2.2.



19



Mức độ phù hợp giữa các chất có trong mẫu nghiên cứu và chất đề nghị được

xác định bằng đại lượng độ tương hợp khối phổ (Match). Độ tương hợp càng cao thì

kết quả định danh càng chính xác. Khi phổ khối của một chất phân tích hoàn toàn

giống với phổ khối của một chất chuẩn trong thư viện thì độ tương hợp khối phổ được

biểu thị là 1000. Độ tương hợp đạt trên 800 được xem là cho kết quả có độ tin cậy cao.

Đồng thời dựa trên tỉ lệ diện tích peak của các cấu tử xác định được % hàm lượng các

chất có trong mẫu phân tích.

3.3 TÁCH PHÂN ĐOẠN TINH DẦU TRẦM HƯƠNG BẰNG PHƯƠNG

PHÁP SẮC KÝ CỘT TRUNG ÁP

3.3.1 Mô tả hệ thống



Hình 3.7 Hệ thống sắc ký cột

Hệ thống gồm cột sắc ký bằng thủy tinh, đầu cột được ráp nối với một hệ thống

bơm nén, áp lực bơm có thể điều chỉnh. Máy bơm hút dung mơi từ bình chứa đẩy vào

đầu cột, từ đó giúp đẩy chất đi qua lớp hấp thu nhanh hơn. Đầu dưới cột được gắn vào

máy phân đoạn.



20



3.3.2 Tiến hành lên cột sắc ký

Sử dụng cột có kích thước:

- Đường kính cột: d = 1,7cm.

- Chiều cao cột: h = 90cm.



Hình 3.8 Cột sắc ký

Chất hấp thu sử dụng là silicagel đối với pha thường có cỡ hạt từ 40-60 µm.

Lượng silicagel đã dùng: m = 120g.

Lựa chọn dung mơi chạy cột thích hợp: n- hexane và ethyl acetate (từ dung môi

không phân cực đến phân cực)

- Dung môi n- hexane dùng để tách các chất không (kém) phân cực.

- Ethyl acetate dùng để tách các chất có độ phân cực trung bình.

Nạp chất hấp thu vào cột (nhồi cột): sử dụng phương pháp nhồi khơ. Cố định cột

thẳng đứng, dùng phễu rót silicagel vào cột và nén chặt (chừa một khoảng phía trên để

nạp mẫu) sau khi nạp xong tiến hành bơm dung môi để ổn định cột.



21



Sau khi ổn định cột, ta tiến hành nạp mẫu, lúc này mặt thoáng của silicagel

trong cột phải bằng phẳng. Mẫu là tinh dầu nên ta tiến hành nạp dung dịch mẫu lỏng

với thể tích mẫu: V= 3mL. Dùng pipet để hút dung dịch mẫu, đặt đầu của pipet gần sát

với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành

trong của cột cho dung dịch chất chảy dọc theo thành trong của cột chạm xuống bề mặt

chất hấp thu.

Kỹ thuật dùng để giải ly ra khỏi cột: sử dụng lực đẩy. Dùng máy bơm hút dung

mơi từ bình chứa đẩy vào đầu cột, từ đó đẩy chất ra khỏi cột. Có thể điều chỉnh tốc độ

dòng chảy của dung mơi nhờ van điều chỉnh của máy bơm, tốc độ bơm: 3mL/phút, áp

suất: 3 bar.

- Quy trình chạy cột với dung mơi n- hexane và ethyl acetate:



a)



c)

d)

b)

Hình 3.9 Quy trình sắc ký cột tinh dầu Trầm hương.



a) Đầu tiên, tiến hành chạy cột với dung môi n- hexane. Lớp màu vàng bắt đầu

tách ra sau đó chuyển sang giai đoạn trong suốt không màu.

b) Tiếp theo, thay đổi tỉ lệ dung mơi n- hexane : ethyl acetate lên 9:1 thì tách được

lớp có màu vàng nhạt.



22



c) Khi tăng tỉ lệ dung mơi n- hexane : ethyl acetate đến 8:2 thì xuất hiện lớp màu

vàng đậm tách ra.

d) Bắt đầu xả cột bằng dung mơi ethyl acetate 100% thì tách ra được lớp màu nâu

đậm.

Khi dung môi ra khỏi cột, ta thu chúng vào các phân đoạn khác nhau nhờ vào

máy phân đoạn theo thời gian hay theo thể tích. Hứng bằng hủ bi dung tích 20mL, mỗi

chu trình sẽ được hứng với 36 hủ bi.



Hình 3.10 Một chu trình của máy phân đoạn hứng tự động.

Tổng số phân đoạn tách được là 525 phân đoạn. Sau đó, đem vào máy thổi khí

nitơ đuổi dung mơi.



23



Hình 3.11 Hình minh họa cho một phân đoạn tách được.

3.4 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN TẠO MÙI HƯƠNG ĐẶC TRƯNG TRONG

TINH DẦU TRẦM HƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CẢM

QUAN VÀ PHÂN TÍCH GC-MS

Để đảm bảo chất lượng của phương pháp đánh giá cảm quan, ta tiến hành lập

phiếu khảo sát các đối tượng. Trong phiếu khảo sát gồm các nội dung như thang điểm

sử dụng tương ứng với những thuật ngữ mô tả cấp độ của tính chất cần đánh giá, trật tự

trình bày mẫu phù hợp với nhãn mẫu, bảng ghi lại kết quả cho điểm.

Đối với phiếu khảo khát đánh giá mùi tinh dầu trầm hương, thang điểm và thuật

ngữ mô tả được sử dụng như sau:

Mức độ đánh giá (thang điểm từ 3+ đến 3-)

3+: Mùi giống mùi trầm hương nhất



1-: Mùi khó chịu nhẹ



2+: Mùi thơm trung bình



2-: Mùi khó chịu trung bình



1+: Mùi thơm nhẹ



3-: Mùi khó chịu nặng



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×