Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP



GVHD: PGS.TS MAI ĐÌNH TRỊ



Trang 24



2.4.2 Hóa chất

-



Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien F 254



-



(Merck) dùng cho pha thường.

Hạt silicagel (Merck) pha thường cỡ hạt 0,04 – 0,06 mm.

Dung mơi hữu cơ dùng cho q trình thí nghiệm gồm: n-hexane, ethyl acetat,



-



chloroform, methanol, ethanol, nước cất.

Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: H2SO4 10%.



2.5 Phương pháp phân lập cách hợp chất

2.5.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

“Sắc ký lớp mỏng dựa vào hiện tượng hấp thu. Trong đó, pha động là một dung

mơi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là chất hấp thu trơ

như silicagel, aluminium oxide. Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên

trên bề mặt phẳng (tấm nhôm hoặc tấm plastic).

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254

(Merck 1,05715). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm

hoặc dùng thuốc thử H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng trên

bếp điện từ từ đến khi hiện màu.”

2.5.2 Sắc ký cột (CC)

“Sắc ký cột là phương pháp tách các chất dựa vào độ phân cực của từng chất. Ở

phương pháp này, pha tĩnh là chất nhồi cột, ở đây là silicagel, pha động là dung mơi. Thứ

tự ra khỏi cột: hợp chất có ái lực nhiều với pha động thì có xu hướng ra khỏi cột trước,

hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị giữ lại trong cột lâu hơn và ra sau [5].

Sắc ký cột được tiến hành trên cột thủy tinh, với chất nhồi cột là silicagel pha

thường với kích thước hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh).”

2.6 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

“Để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sử dụng kết hợp xác định các

thông số vật lý bằng các phương pháp phổ hiện đại đồng thời kết hợp phân tích, tra cứu

tài liệu tham khảo. Phương pháp được sử dụng là: Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) [4].”

Phổ NMR đo trên máy Bruckker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS), tại

Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP



GVHD: PGS.TS MAI ĐÌNH TRỊ



Trang 25

-



Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC.

Dung môi được sử dụng là dung môi CDCl3. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc

vào bản chất của từng mẫu, theo ngun tắc dung mơi phải hòa tan hồn tồn mẫu

thử.







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP



GVHD: PGS.TS MAI ĐÌNH TRỊ



Trang 26



CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM

3.1 Thu hái và xử lí mẫu

“Thu hái lá Trôm (Sterculia foetida L.) tại khu vườn trồng của nơng dân tại thơn 6,

xã Vũ Hòa, huyện Đức Linh, tỉnh Bình Thuận vào tháng 10 năm 2017. Từ 30 kg lá tươi

sau khi được thu hái rửa sạch, phơi khơ tự nhiên trong khơng khí ở nhiệt độ phòng

(khoảng 20oC-30oC), tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời trong khoảng thời

gian 14 ngày, thu được 12 kg mẫu lá Trơm khơ.”

3.2 Quy trình chiết cao

“Bột lá Trơm khơ (12 kg) được trích bằng ethanol 96 0 theo phương pháp ngâm dầm ở

nhiệt độ phòng tại phòng thí nghiệm khoa mơi trường Đại học Sài Gòn. Cô quay thu hồi

dung môi dưới áp suất thấp, thu được 1.83 kg cao ethanol thô.

Thực hiện phương pháp chiết lỏng – lỏng trên cao ethanol thô lần lượt với các dung

môi: hexane, chloroform và ethyl acetate. Đuổi dung môi phần dịch chiết, thu được các

phân đoạn cao tương ứng: cao hexane (450 g), cao chloroform (650 g), cao ethyl acetate

(30.1 g) và dịch chiết còn lại. Từ các cao phân đoạn tiến hành cô lập các hợp chất bằng

các phương pháp sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký điều chế. Quy trình điều chế các

loại cao từ lá cây Trơm (Sterculia foetida L.) được trình bày cụ thể ở sơ đồ 1.”



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP



GVHD: PGS.TS MAI ĐÌNH TRỊ



Trang 27



Lá Trơm tươi Sterculia foetida L. (30.0 kg)



phương pháp phổ n sát cấu trúc bệmĐ

Phơi khô, xay nhuyễn

Bột Trôm khô (12.0 kg)

* Ngâm dầm với ethanol

* Lọc, cô quay, thu hồi dung môi

Cao ethanol thô (1.83 kg)

Bột Trôm khô (12.0 kg)

* Chiết lỏng – lỏng với hexane



Cao n-hexane (450.5 g)



Dịch chiết còn lại

* Chiết lỏng – lỏng với chloroform



Cao chloroform (650 g)



Dịch chiết còn lại

* Chiết lỏng – lỏng với ethyl acetate

* Lọc, cô quay, thu hồi dung mơi



Cao ethyl acetate (30.1 g)



Dịch chiết còn lại



Các hợp chất cô lập được

* SKC silica gel

* SKLM điều chế



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP



GVHD: PGS.TS MAI ĐÌNH TRỊ



Trang 28



Khảo sát cấu trúc bằng phương pháp phổ nghiệm



Sơ đồ 1: Quy trình cơ lập các hợp chất trên lá Trôm (Sterculia foetida L.)

3.3 Phân lập các hợp chất

3.3.1 Chuẩn bị sắc ký cột

3.3.1.1 Nhồi cột

-



Chọn cột phù hợp với lượng cao đã chuẩn bị, làm khơ cột.

Cho ít bơng gòn ở dưới đáy cột, ngay phía trên vòi nhỏ giọt, để silicagel khơng



-



chảy ra ngoài.

Cân lượng silicagel vừa đủ cho vào cốc thuỷ tinh cùng với dung mơi ít phân cực,



-



trộn đều.

Đổ hỗn hợp silicagel và dung môi vào cột. Mở cột chạy để ổn định cột.

3.3.1.2 Nạp cao vào cột



-



Làm khô cao với một ít silicagel thành hỗn hợp bột khơ, mịn và đồng nhất.

Cho hỗn hợp đó vào cột đã chuẩn bị bằng phễu thuỷ tinh.

Tiếp đó, cho từ từ dung môi vào cột và tiến hành phân lập

3.3.2 Phân lập hợp chất trong cao n-hexane



Tiến hành sắc ký cột cao n-hexane với hệ dung môi là n-hexane (H) : ethyl ecetat

(EA) (100% H, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 100%Ea). Sau đó, khi dung dịch nhạt màu thì thay

bằng hệ ethyl acetat (EA) : methanol (Me) (10:1).

Trong suốt quá trình chạy sắc ký cột, sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng

(TLC) giải ly bằng hệ H:EA hay Clo:Me theo tỉ lệ thích hợp để kiểm tra và thăm dò các

chất có trong cao thô và các phân đoạn, gom các phân đoạn có các vết giống nhau lại.

Từ cao n-hexane ban đầu phân ra được 7 phân đoạn là: H1 (56 g), H2 (40 g), H3

(60 g), H4 (70 g), H5(58 g), H6 (65 g), H7 (55 g).

 Phân lập phân đoạn H3 (60 g)



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP



GVHD: PGS.TS MAI ĐÌNH TRỊ



Trang 29



Từ phân đoạn H3, ta tiếp tục thực hiện sắc ký cột để phân lập các hợp chất với hệ

dung môi n-hexane (H) : ethyl ecetat (EA) (10:1, 5:1, 3:1,1:1). Kiểm tra và thăm dò các

vết bằng sắc ký bản mỏng TLC giải ly bằng hệ H:EA. Ta gom các phân đoạn có vết giống

nhau lại thu được các phân đoạn: H3-I, H3-II, H3-III.

Qua kiểm tra các phân đoạn bằng TLC, ta nhận thấy phân đoạn H3-II và H3-III

xuất hiện các vết đẹp, rõ ràng hơn các phân đoạn khác nên tiếp tục khảo sát ở phân đoạn

H3-II và H3-III.

 Phân lập phân đoạn H3-II



Phân đoạn H3-II tiếp tục thực hiện sắc ký cột với với hệ dung môi n-hexane (H) :

ethyl ecetat (EA) (5:1, 3:1, 1:1, 1:2). Kiểm tra và thăm dò các vết bằng sắc ký bản mỏng

TLC giải ly bằng hệ H:EA. Ta gom các phân đoạn có vết giống lại thu được các phân

đoạn: H3-II.1, H3-II.2, H3-II.3, H3-II.4, H3-II.5.

Qua kiểm tra các phân đoạn bằng TLC, ta nhận thấy phân đoạn H3-II.4 có vết đẹp,

nên tiếp tục thực hiện sắc ký cột và thu được mẫu LT02.

 Phân lập phân đoạn H3-III



Phân đoạn H3-III tiếp tục thực hiện sắc ký cột với với hệ dung môi n-hexane (H) :

ethyl ecetat (EA) (3:1, 1:1, 1:2 ). Kiểm tra và thăm dò các vết bằng sắc ký bản mỏng TLC

giải ly bằng hệ H:EA. Ta gom các phân đoạn có vết giống lại thu được các phân đoạn:

H3-III.1, H3-III.2, H3-III.3, H3-III.4..

Qua kiểm tra các phân đoạn bằng TLC, ta nhận thấy phân đoạn H3-III.3 có vết

đẹp, nên tiếp tục thực hiện sắc ký cột và thu được mẫu LT04.



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP



GVHD: PGS.TS MAI ĐÌNH TRỊ



Trang 30



Cao n-hexane

(450.5 g)



SKC: H:Ea (100% H, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1,

100%Ea) và Ea:Me (10:1)



H:Ea

(20:1)



100%

H



H:Ea

(10:1)



H:Ea

(5:1)



Ea:Me

(10:1)



100% Ea



H:Ea

(1:1)



H1



H2



H3



H4



H5



H6



H7



(56 g)



(40 g)



(60 g)



(70 g)



(58 g)



(65 g)



(55 g)



SKC: H:Ea (10:1, 5:1, 3:1,

1:1)



H3-II

SKC: H:Ea (5:1,

3:1,1:1, 1:2)



LT02



H3-III

SKC: H:Ea (3:1, 1:1,

1:2)



LT04



Sơ đồ 2: Qui trình cơ lập các hợp chất từ cao n-hexane



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP



GVHD: PGS.TS MAI ĐÌNH TRỊ



Trang 31



CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

“Từ cao n-hexane của lá cây Trôm, bắng phương pháp sắc ký cột với các dung mơi

có độ phân cực khác nhau ta đã phân lập được hai hợp chất.”

4.2 Kiến nghị

“Trôm là loại cây gần gũi với đời sống người dân Việt Nam và trong dân gian

thường dùng làm thuốc chữa một số bệnh. Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về

loại cây này. Tiềm năng cây chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cần thiết giúp cho

việc điều trị bệnh là rất cao nên cần tiếp tục tiến hành phân lập các phân đoạn khác trên

cao ethyl acetate, cao choloform và thực hiện tiếp việc nghiên cứu với các bộ phận khác

của cây như: cành, rễ, thân, …”



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP



GVHD: PGS.TS MAI ĐÌNH TRỊ



Trang 32



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu trong nước

[3].Võ Văn Chi. (2002). Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, tr. 1083.

[6].Phạm Hoàng Hộ. (1999). Cây cỏ Việt Nam, quyển 1. NXB Trẻ, mục 2022 - 2047, tr.

502- 506.

[7].Võ Văn Chi. (2007). Sách tra cứu cây cỏ ở Việt Nam. Nhà xuất bản Giáo Dục,

TPHCM ,tr. 31- 36.

[8].Võ Văn Chi. (2004). Từ điển thực vật thông dụng, tập 2. Nhà xuất bản khoa học kĩ

thuật, tr. 2340

Tài liệu nước ngoài

[1].Ru-Feng Wang et.al. (2003). Alkaloids from the seeds of Sterculia lychnophora.

Phytochemistry, 63, p.475-478.

[2].Costa DA., Chaves MH., Silva WCS., Costi LS., (2010). Chemical constituents, total

phenolics and antioxidant activity of Sterculia striata, St. Hil. et Naudin. Acta Amazon,

40(1), p. 207-12.

[4].Hussain SS., Janarthan M., Anusha SK., Ranjani M. (2014). Preclinical evaluation of

anti-diabetic and anti-hyperlipidemic activity of methanoic extracts of Sterculia foetida

leaves by using Wistar albino rats. Indian Journal of Research in Pharmacy and

Biotechnology, 2(6),p.1430.

[5].Vital PG., Velasco Jr. RN, Demigillo JM., Rivera WL. (2010). Antimcrobial activity,

cytotoxicity and phytochemical screening of Ficus septica Burm and Sterculia foetida L.

leaf extracts. Journal of Medicinal Plants Research, 4(1), p. 58-63.

[9].Loenzi .H.;Bacher, L. ; Lacerda, M. ; Sartori.S-Instituto Plantarum De Estudos Da

Flora LTDA;Brazil .(2000). Brazillan Fruits and Cultivated Exotics,p. 47

[10].Loenzi .H -Instituto Plantarum

Brazillian.Volume 1.4 th Edition



De



Estudos



Da



Flora



;Brazil.



(2002).



[11].Md.Kamal Hossain, Md. Akhtaruzzaman Prodhan, A. S. M. Ibnul Hasan Even,

Helal Morshed and Md. Monir Hossain. (2012). Anti-inflammatory and antidiabetic

activity of ethanolic extracts of Sterculia villosa. Journal of Applied Pharmaceutical

Science, 02 (08), p. 96-100.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×