Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
2 Nuôi cấy vi sinh vật

2 Nuôi cấy vi sinh vật

Tải bản đầy đủ - 0trang

Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

- Nuôi cấy các tế bào trên trong môi truờng dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc

riêng rẽ, cách biệt nhau.

2. Qúa trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết

Với hầu hết các mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết

bao gồm các bước sau:

- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu.

- Phân lập vi sinh vật thuần khiết.

- Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc.

a) Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẻ trên các môi trường phân lập:

- Nếu mẫu ban đầu ở dạng đặc phải đưa về dạng lỏng bằng cách

+ Nghiền mẫu

+ Hòa tan mẫu trong nước cất vô trùng.

Sau thực hiện như dạng mẫu lỏng.

+ Tiếp tục pha loãng ở nồng độ cần thiết.

+ Cấy mẫu trên mơi trường đặc trưng của nó.

- Chú ý: Nếu khơng có mơi trường đặc trưng có thể sử dụng mơi trường mà vi sinh vật

cần phân lập phát triển bình thưòng ( có thể bổ sung các chất ức chế các loại vi sinh

vật khác).

b) Phân lập các vi sinh vật trên môi trường đặc ở đĩa petri

- Đối với vi sinh vật hiếu khí.

+ Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha lỗng cho vào đĩa pêtri có mơi trường thích hợp .

+ Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.

+ Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ 2 rồi dĩa

thứ 3.

+ Đặt các đĩa pêtri 1, 2,3 trên vào các tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp, sau một thời gian

nhất định tùy vào giống vi sinh vật ta sẽ có được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa thứ

2 và 3

- Đối với vi sinh vật kị khí.

+ Dùng mơi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thủy để loại bỏ khơng khí

trong mơi trường.

+ Để nguội mơi trường còn 450 – 500C.



17



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

+ Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống mơi trường, đậy nút lại , lắc tròn quanh trục

ống nghiệm.

+ Rót nhanh mơi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật nhanh

nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường khơng còn khơng khí.

+ Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa pêtri và ủ ở nhiệt độ thích

hợp.

+ Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường,

dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào mơi trường lỏng thích hợp.

c) Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập:

Có nhiều cách kiểm tra:

- Kiểm tra vết cấy:

Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên môi trườg đặc.

+ Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập

tinh khiết thì giữ lại.

+ Nếu vết cấy khơng thuần nhất thì loại bỏ.

- Kiểm tra lại độ thuầm khiết của các khuẩn lạc:

+ Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng.

+ Tách các khuẩn lạc này ra và hòa tan, pha lỗng ở nồng độ cần thiết trong nước cất

vơ trùng.

+ Nhỏ một giọt dịch trên vào đĩa pêtri có môi trường.

+ Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, rồi đĩa thứ

2, thứ 3.

+ Đặt các đĩa pêtri trên vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy loại vi sinh

vật.

+ Sau lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện

thuần khiết của giống.

3) Phân lập một số giống vi sinh vật trong thực tế

a) Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis:

- Cỏ khơ cắt nhỏ, cho vào 1 bình tam giác

- Bổ sung thêm : + Một chút phân

+ Nước sạch đổ ngập cỏ.

- Đun sôi 15 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng và các tế bào kháng sinh bào tử.

18



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

- Đậy nút bông, để tủ ấm ở nhiệt độ 25- 260C trong 48- 72 h.

- Kết quả:

Xuất hiện các lớp váng xám có nhiều vi khuẩn Bacillus subtilis vì cỏ khơ bao giờ cũng

có bào tử của vi khuẩn này.

+ Trên kính hiển vi: Tế bào Bacillus subtilis có hình que, dài, bào tử hình ơvan nằm ở

xa tâm hay gần tâm khuẩn lạc. Tế bào có kích thước ( 3 -5 x0,6) m.



b) Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Mucor

- Có thể phân lập nấm mốc này trên cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khơ ít

ngày.

19



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

- Thông qua màu sắc của mốc để nhận diện.

+ Mốc có màu trắng: Có thể là Mucor hay Rhizopus.

+ Mốc có màu đen là Aspergillus niger

+ Mốc có màu xanh lục là Penicilium italicum

Loại mốc này thường có trên vỏ cam, chanh để lâu ngày

- Dùng que cấy đầu hình thước thợ lấy 1 ít sợi nấm cấy vào mơi trường thạch nghiêng

thích hợp (Czapek)

c) Thu nhận nấm men :

- Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ các môi trường như :

+ Bề mặt trái cây và dịch ép một số trái cây như táo, lê, nho, dâu, mơ, dứa…

+ Trong rượu nếp, trong các bánh men rượu, trong bia, trong nước mía để vài hơm,

trong hạt kiphia.

- Nấm men này khi quan sát trên kính hiển vi thường có dạng hình cầu hay hình trứng.

Tế bào có kích thước lớn, có khả năng nảy chồi, khuẩn lạc có màu trắng sữa

- Chọn các khuẩn lạc nấm men riêng rẽ và cấy vào mơi trường thích hợp ( mơi trường

khoai tây - đường cám )



Mốc Aspergillus niger

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

1. Khái niệm

Qúa trình ni cấy bao gồm 2 cơng đoạn ni và cấy

- Ni là q trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động

và phát triển của vi sinh vật.

20



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

- Cấy : là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường

thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng.

Hai khâu này luôn gắn bó với nhau, khơng thể tách rời nhau trong quá trình nghên cứu

và ứng dụng vi sinh vật.

2. Mục đích của việc ni cấy

- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu, vật phẩm cần nghiên cưú.

- Tiến hành nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng

- Bảo tồn các giống thuần khiết.

- Nghiên cứu các đặc tính sinh học và hệ thống sinh trưởng của chúng.

3. Nguyên tắc

- Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm.

- Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng triệt để.

- Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển.

4. Các phương pháp nuôi cấy

a) Phương pháp chung của việc cấy chuyền ( lấy việc cấy truyền từ ống nghiệm chứa

giống sang ống nghiệm chứa mơi trường làm ví dụ) : gồm các thao tác chính sau :

- Dán nhãn ghi :Tên giống vi sinh vật, ngày cấy) vào thành ống nghiệm, dưới nút

bông một chút.

- Tay trái cầm 2 ống nghiệm : 1 ống giống và 1 ống môi trường

- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy

- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bơng vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống

giống ra

- Hơ nóng để khử trùng khơng khí ở miệng 2 ống nghiệm

- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống

giống.

- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống mơi

trưòng để thực hiện các thao tác cấy truyền.

- Khử trùng lại phần khơng khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông

- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong.

- Chú ý :

+ Nêú ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút canh trường thay

que cấy.

21



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

+Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ ống hút sau khi tháo giấy bao

gói.

+ Sử dụng xong cắm ống hút vào dung dịch cromic để khử trùng.

b) Phương pháp nuôi cấy trên thạch nghiêng :

Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.

- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên

- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp theo :

+ Hòa giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm

+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu

 Hình chữ chi

 Hình vòng xoắn

 Hình vạch song song

c) Phương pháp cấy trên thạch đứng : Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị

khí.

- Sử dụng que cấy hình kim

- Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ

- Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường : 1 đường chính giữa, 2 đường sát

thành ống tùy theo yêu cầu.

- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gãy nứt, vỡ mơi trường.

d) Phương pháp cấy trên đĩa pêtri :

Có thể cấy trên đĩa pêtri theo một trong hai cách sau :

* Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau :

- Để đĩa pêtri lên bàn.

- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở phương pháp

chung

- Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào.

- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một trong các kiểu sau :

+ Theo hình chữ chi trên tồn bộ mặt thạch

+ Theo những đường song song

+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc.

* Dùng pipet : Thường áp dụng để định lượng vi sinh vật và cấy lượng khá nhiều

giống. Có 2 cách ;

22



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

- Cách 1 :

+ Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm

có mơi trường thạch ở nhiệt độ 500C.

+ Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường.

+ Đổ thạch này vào đĩa pêtri đã khử trùng.

+ Xoay tròn đĩa pêtri cho thạch dàn đều ở đáy hộp.

+ Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp.

- Cách 2 :

+ Hút 0,1 ml dịch cấy, nhỏ vào đĩa pêtri có mơi trường đặc.

+ Dùng que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa.

+ Cất vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy lồi vi sinh vật.

e) Các điều kiện nuôi của vi sinh vật :

Để bảo đảm sự phát triển của vi sinh vật, sau khi cấy xong phải quan tâm đến các điều

kiện nuôi dưỡng chúng . Các điều kiện đó bao gồm

* Nhiệt độ : Tùy loại vi sinh vật khác nhau, chọn nhiệt độ tối thích cho sự phát triển

của chúng và duy trì sự ổn định nhiệt độ đó.

* Độ ẩm : Để duy trì độ ẩm trong q trình ni cần :

- Đảm bảo đủ lượng nước khi làm môi trường.

- Trong điều kiện cần thiết có thể phun nước vơ khuẩn vào phòng ni hoặc để nước

bốc hơi trong tủ ấm.

* Ơxi :

- Đối với vi sinh vật hiếu khí :

+ Cung cấp thường xuyên và đầy đủ O2

+ Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải.

+ Các bình chứa mơi trường được lắc thường xun trong q trình ni để cung cấp

thêm ôxi cho vi sinh vật.

+ Nếu nuôi cấy trong mơi trường có khối lượng lớn vừa phải tiến hành sục khí thường

xuyên hay định kỳ.

- Đối với vi sinh vật kị khí :

+ Hạn chế sự tiếp xúc với ôxi bằng cách :

Đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vazơlin

Cấy trích sâu vào mơi trường đặc.

23



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

Nuôi cấy trong bình hút chân khơng.

Ni cấy trong mơi trường ống nghiệm đặc biệt sau khi rút hết khơng khí và hàn

kín lại

Đun sơi mơi trường một thời gian để loại hết O 2. Để nguội 450C. Dùng ống hút

cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên

bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với O2.

g) Kết quả của việc nuôi cấy :

Sau khi ni ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật ta thấy :

- Trong môi trường lỏng : Vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường.

_ Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng :

+ Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên vệt nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục.

+ Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy.

- Trong môi trường thạch đứng : Các vi khuẩn kị khí phát triển đáy của cột mơi trường.



24



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường



CHƯƠNG 3

LẤY MẪU VÀ PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

3.1 Phương pháp lấy mẫu để phân tích vi sinh vật

3.1.1. Xác định số lượng mẫu và dụng cụ để lấy mẫu

+ Xác định số lượng mẫu cần lấy:

- Phụ thuộc vào mục tiêu, nội dung nghiên cứu mà định ra yêu cầu số lượng và vị trí

lấy mẫu phải đại diện.

- Phụ thuộc vào điều kiện cụ thể ngoài thực địa, hay khu vực cần lấy mẫu phân tích

Điều quan trọng nhất người lấy mẫu phải thực hiện là lấy mẫu sao cho đồng nhất và

phải đại diện được khu vực, khoanh đất hay cơ chất cho khu đó, vùng đó.

Ví dụ : số lượng tương ứng các mẫu cơ chất trong các đống phế thải, rác thải…. được

lấy từ khu vực đã điều tra và được trộn lẫn để tạo thành một mẫu đại diện.

+ Các vật liệu cần chuẩn bị để lấy mẫu

- Dụng cụ lấy mẫu ( dao, kéo, lõi trụ, mai thuồng…)

- Cồn, bông vô trùng

- Xô đựng

- Túi đựng mẫu

- Thùng làm lạnh

+ Mẫu đại diện

Các mẫu ngẫu nhiên có thể chỉ để trộn đều nếu chúng được lấy từ một khu vực đồng

nhất và đại diện.

Ví dụ : Nếu lấy mẫu đất để phân tích VSV đất ( cần dựa vào yêu cầu của mục tiêu

nghiên cứu, độ chính xác đến đâu, lấy bao nhiêu mẫu, diện tích rộng hẹp của từng

khoanh đất…)

- Diện tích

- Địa hình

- Độ sâu theo tầng phẫu diện đất

- Loại hình sử dụng đất

- Cây trồng

- Điều kiện độ ẩm



25



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

Các mẫu đất cần được lấy khác biệt thực sự. Những khác biệt lớn trong vùng lân

cận phải được loại trừ khỏi mẫu. Nếu chúng có tầm quan trọng đặc biệt thì mẫu

phải được lấy riêng rẽ.

3.1.2. Phương pháp lấy mẫu và vận chuyển mẫu

3.1.2.1. Nguyên tắc lấy mẫu

- Để đảm bảo mẫu đại diện, các điểm lấy mẫu phải được phân bố ngẫu nhiên

trong diện tích điều tra. Điều này tốt nhất được tiến hành theo phương pháp lấy điểm

theo đường chéo nếu địa hình đồng nhất và diện tích < 1000 m2 sẽ lấy 5 điểm đại diện.

- Lấy mẫu không nên gần bờ ruộng hoặc đường, vì số lượng VSV trong mẫu đất

đó sẽ khơng đại diện cho khoang đất ở chính vùng đó.

Khi lấy mẫu gạt bỏ lớp rễ có bề mặt (nếu có), sau đó cắt vng xuống phía dưới. Cứ

như vậy lấy càng nhiều điểm càng tốt. Lấy được điểm nào lập tức phải cho ngay vào

túi đựng mẫu để tránh sự nhiễm tạp.

- Nếu ruộng lấy mẫu đanh thâm canh các loại cây trồng cạn, mặt ruộng khơng

đồng nhất thì phải xem xét cụ thể thực địa để lấy mẫu sao cho đồng nhất và chính xác.

Ví dụ: luống khoai, ngơ, sắn, đậu, lạc, rau… thì khơng được lấy đất ở trên mặt luống

và ở dưới rãnh luống, mà phải lấy ở sườn luống, không được lấy gần gốc cây trồng.

- Lấy mẫu đất để phân tích tốt nhất vào thời gian đất tương đối ổn định, nghĩa là

người dân không tác động nhiều vào đât (thường sau khi thu hoạch)

- Lấy mẫu từ các cơ chất khác, như: đống rác thải, phế thải,… cũng cần phải

xem xét rất cụ thể thực địa sao cho lấy mẫu chuẩn nhất, đại diện nhất khu vực nghiên

cứu.Trọng lượng cần lấy khoảng 200gam/ l mẫu

- Lấy mẫu phân tích VSV phải đảm bảo nguyên tắc là vô trùng, tránh sự nhiễm

tạp, lấy xong phải cho mẫu vào phích lạnh đựng mẫu ( vì sinh sản của VSV cực nhanh,

nếu khơng bảo quản trong điều kiện lạnh ngay, số liệu phân tích sẽ khơng chính xác)

3.1.2.2. Vận chuyển mẫu.

- Mẫu để phân tích VSV, tốt nhất lấy xong chuyển ngay về phòng phân tích để

bảo quản. Trong qua trình vận chuyển mẫu không được làm thùng túi đựng mẫu và

luôn luôn giữ trong phích lạnh ( để kìm hãm sinh trưởng và phát triển của VSV trong

mẫu)

3.1.2.3. Bảo quản mẫu



26



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

2 Nuôi cấy vi sinh vật

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×