Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Bài 3: PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CÁC LOẠI VI KHUẨN.

Bài 3: PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CÁC LOẠI VI KHUẨN.

Tải bản đầy đủ - 0trang

Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

1.2 Môi trường và thiết bị

- Dung dịch Salin Pepton

- Thạch Violet red bile (VRBL)

- Canh Brilliant Green Bile Salt (BGBL)

- Thạch Tryptone Soya (TSA)

- Tủ ấn 37±10C

1.3 Quy trình

- Đỗ đĩa: chuyển 1ml dung dịch dung dịch mẫu sau khi đã pha lỗng cho vào đĩa petri

vơ trùng, sử dụng hai nồng độ pha loãng liên tiếp. Đổ vào mơic đĩa khoản 5ml mơi

trường TSA ở 450C. Sau đó cho mơi trường đơng hồn tồn đổ thên 10-15ml mơi

trường thạch VRBL 450C

- Nuôi ủ: Các đĩa được lật ngược và ủ trong 24±3 giờ ở 37±10C

1.4 Đọc kết quả

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 100 sau 24 giờ ni cấy. Khuẩn lạc coliforms có

màu đỏ tía, đường kính 0.5mm, đơi khi được bao quanh bởi một vùng hơi đỏ do tủa.

Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng đê qui về số coliform trong một g mẫu.

1.5 Khẳng định.

Cấy riêng ít nhất 5 khuẩn lạcn nghi ngờ của mỗi loại vào các ống nghiệm chứa mơi

trường canh BGBL có ống Durham , ủ ở 37 0C trong 24 giờ. Phản ứng được coi là

dương tính khi có sự tạo khí dù chỉ một trong 5 ống nghiệm trên.

3. Escherichia coli

- Phương pháp: tham chiếu theo TCVN 5287, ấn bản lần 2, 1994

1.1 Nguyên tắc



39



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

Cấy một lượng dịch mẫu vào môi trường tăng sinh (canh Brilliant green bile lactose),

lựa các khuẩn lạc điển hình trên mơi trường chọn lọc (EMB) để các phép thử sinh hóa

phù hợp (nghiệm pháp IMViC)

1.2 Môi trường và thiết bị

- Dung dịch Saline (SPW).

- Canh Brilliant green bile lactose BGBL.

- Thạch Eosin Methylene Blue Lactose (EMB)

- Canh Methyl Red Voges Proskauer (MR-VP)

- Canh Tryptone (hoặc peptone)

- Thạch Simmons Citrat

- Thuốc thử Methyl red 0,2%, α-naphtol 5%, kovac’s.

- Dung dịch KOH 40%

- Tủ ấm 37±10C, 44±10C

1.3 Quy trình

- Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu nồng độ 10 -1 vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường

tăng sinh (BGBL), ủ 44,0±0,50C 24 giờ.

- Cấy phân lập: Sau khi tăng sinh cấy dịch mẫu từ ống nghiệm có phản ứng dương tính

(mơi trường chuyển đục và sinh hơi) sang môi trường EMB, ủ 37±1/24 giờ. Trên mơi

trường EMB: khuẩn lạc màu tím, ánh kim, tròn, bờ điều, đường kính khoảng 0,5mm

1.4 Khẳng định

- Chọn ích nhất 2 khuẩn lạc điển hìnhtreen mơi trường chọn lọc sang môi trường thạch

không chọn lọc (TSA) ủ ở 37±10C trong 19-24 giờ.

- Kết quả thử nghiệm sinh hóa E. coli phù hợp: indol(+), methyl red(+), voges

proskauer(-), khẳng sử dụng citrat(-)

1.5 Đọc kết quả & báo cao

40



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

Phát hiện hay không phát hiện

4. Salmonella

- Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 71 ấn bản lần 5. Năm 1999

1.1 Nguyên tắc

- Phương pháp này chỉ dùng để định tính phát hiện hay khơng phát hiện

- Quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải qua bốn gia đoạn: tiền tăng sinh, tăng

sinh, phân lập và khẳng định.

1.2 Môi trường và thiết bị

- Canh Peptone đệm (BPW).

- Canh Rappaport-Vasiliadis soy peptone.

- Thạnh Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS)

- TSI, TSA

- Canh Lysine decarboxylase, Urea phenol red, Manitol Phenol red báe

- Bể điều nhiệt ±0.20C

- Tủ ấm 37±10C

1.3 Quy trình

- Lấy mẫu: Lấy mãu ở vùng bề mặt càng rộng càng tốt

- Tiền tăng sinh: trộn 25g mẫu với 225ml nước đệm peptone đệm, đônh nhất nhất băng

máy dập mẫu. Ủ ở 37±0,10C từ 18 đến 24 giờ

- Phân lập: tu môi trường sinh cấy chuyển khuẩn dịch lên bề mặt môi trường phân lập

XLD sao cho co thể tạo được những khuẩn lạc tách rời. Lật ngược đĩa ủ ở 37±0,2 0C

trong 24±3 giờ. Trên môi trương XLD khuẩn lac Salmonella điển hình trong, hơi

nhuốm đỏ do sự thay đổi của chất chỉ thị trong mơi trường, phần lớn có tâm đen. Bao

giờ cũng nhận thấy một vung môi trường đỏ lớn hay nhỏ.



41



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

1.4 Khẳng định

Những khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra khảng định bằng thử nghiệm sinh hóa:

Lactose (-), Sucrose (-), Glucose (+), Urease (-), Indol (-), Mannitol (+), VP (-), LDC

(+), ODC (+) và amygdaline (-)

1.5 Đọc kết quả & báo cáo

Phát hiện hay không phát hiện

5. Clostridium perfringens

- Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 56 ấn bản lần 3. Năm 1994

1.1 Nguyên tắc

Định lượng Clostridium bằng cánh cấy một lượng mẫu đã biết vào môi trường thích

hợp có chứa ion Fe3+ và ion (S2O3)2- ủ ở 370C trong 1-2 ngày

1.2 Môi trường và thiết bị

- Thạch iron sulphite

- Dung dich muối peptone pha lỗng

1.3 Quy trình

- Cấy mẫu: Chuyển 1ml mẫu ở nồng độ thích hợp vào ống nghiệm. Sau đó, đổ 12ml

mơi trường thạch iron sulphite vào ống trộn điều mẫu trước khi môi trường đông lại.

Sau khi môi trường đông đổ thêm 2-3ml môi trường thạch iron sulphite lên bề mặt ủ ở

37±10C trong 28-48 giờ

1.4 Đọc kết quả

- Đếm tất cả khuẩn lạc đen, xung quanh có quầng đen nhân với nồng độ pha loãng

6. Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus

- Phương pháp: tham chiếu theo sổ tay phân tích vi sinh FDA , ấn bản lần 8, năm 1995

1.1 Nguyên tắc



42



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

- Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus được nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn

lọc. từ đây dịch khuẩn được cấy chuyền sang môi trường rắn chọn lọc. những khuẩn

lạc giống Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus được thử nghiệm bằng các phản

ứng sinh hóa.

1.2 Môi trường và thiết bị

- Thạch Thiosulphate citrate Bile salt sucrose (TCBS agar)

- Peptone kiềm chứa 1% Nacl (APW)

- TSA + 1,5 %Nacl

- Tủ ấm 37±10C

1.3 Quy trình

+ Tăng sinh: Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào một túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu

lớn thành các mảnh nhỏ rồi thêm 225 ml nước pepton kiềm APW. Dập mẫu 2 phút, ủ ở

37±1 0C trong 6 giờ và 16-24 giờ

+ Phân lập và đọc kết quả: từ môi trường tăng sinh cấy ria vào môi trường TCBS thạch

ủ ở 37,0 ± 1,00C trong 18 - 24 giờ.

+ Trên mơi trường TCBS thạch khuẩn lạc V. cholerae tròn, lớn có đường kính 2-3mm

hơi dẹt, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacaroza), ở giữa đậm và có viền mờ xung

quanh. V. parahaemolyticus tròn, lớn có đường kính 3-4mm , màu xanh dương

1.4 Thử nghiệm sinh hóa

-Khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường không chọn lọc

TSA 1,5% NaCl. ủ ở nhiệt độ 37,0± 1,0oC trong 18 - 24 giờ.

+ Thử nghiệm sơ bộ:

Phép thử



Phản ứng tiêu biểu của



Phản ứng tiêu biểu của



Virio parahaemolyticus



Virio Cholerae



TSI



K/A --



K/A --



Tinh duy động



+



+

43



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường



Oxydase



+



+



KOH



+



+



Phản ứng tiêu biểu của



Phản ứng tiêu biểu của



Virio parahaemolyticus



Virio Cholerae



0% NaCl



-



+



3% NaCl



-



+



6% NaCl



+



-



8% NaCl



+



-



10% NaCl



-



-



Sucrose



-



+



Lactose



-



-



Maninitol



+



+



ONPG



-



+



ADH



-



-



LDC



+



+



Urease



-



+



+ Thử nghiệm khẳng định



Phép thử



Tính chịu mặn



Lên men sinh axít từ



1.5 Báo kết quả

Phát hiện hay không phát hiện

7. Staphylococci aureus Coagulase positive

- Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 66 ấn bản lần 3, 1999



44



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

1.1 Nguyên tắc

Định lương St. aureus Coagulase positive được thực hiện bằng cánh cấy trang một

lượng mẫu đã biết lên môi trường thạnh Bard Parker, vi khuẩn cho những khuẩn lạc

đặt trưng. Và được xác định bằng phản ứng coagulase

1.2 Môi trường và thiết bị

- Dung dịch Saline Peptone

- Thạch Trypton Soya

- Thạch Bảid Parker

- Canh Brain Heart Infusion (BHI)

- Huyết thanh thỏ

- Tủ ấn 37±10C

1.3 Quy trình

Cấy trang 1ml mẫu vào 3 đĩa đĩa petri . lật ngược các đĩa và ủ ở 37±1 0C trong 24±3

giờ và 48±4 giờ

1.4 Đọc kết quả

- Sau 24±3 giờ, trên môi trường Baird Paker khuẩn lạc Staphylococci aureus

Coagulase positive có đường kính 1-1,5mm, màu đen sáng và lồi. Mỗi khuẩn lạc có

quầng sáng rộng 1-2mm bao quanh. Những khuẩn lạc điển hình sẽ được đánh dấu trên

mặt sau của đĩa và tiếp tục ủ thêm 24 giờ nữa.

- Sau 48 giờ Staphylococci aureus Coagulase positive 1,5-2mm có màu đen, sáng và

lồi, quanh khuẩn lạc có một vùng đục mờ hẹp, tiếp đó là một vùng sáng trong rộng 24mm .

- Một vài chủng St. aureus không tạo quầng sáng trong bao quanh, vùng đục sát khuẩn

lạc cũng có thê khơng có (khuẩn lạc khơng điển hình). Cả hai loại khuẩn lạc này điều

được đánh dấu mặt sau của đĩa



45



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

1.5 Khẳng định Cấy 5 khuẩn lạc điển hình và khơng điển hình sang mơi trường TSA ủ

ở 37±10C trong 24 giờ. Từ môi trường TSA cấy chuyển vi khuẩn sang các ống nghiệm

có chứa 0,3ml huyết tương thỏ ủ ở 37±1 0C. kiểm tra sự hình thành khối đông sau 1,3,6

và 24 giờ. Kết quả Dương tinh có sự hình thành khối đơng. Âm tính khơng có sự hình

thành khối đơng



46



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Mơi Trường

Bài 4: ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT

1. Dụng cụ và nguyên vật liệu

1.1 Dụng cụ:

Đĩa petri, cồn 760, nước vơ trùng, bình tam giác hoặc bình cầu 100, 250, 500, 1000ml.

Bình tia, lam kính, đèn cồn, thuốc nhuộm, kính hiển vi….

Mơi trường nuôi cấy chủng giống VSV nghiên cứu

2. Đánh giá đặc tính sinh học theo từng chỉ tiêu:

Việc đánh giá đặc tính sinh học của các vi sinh vật được tuyển chọn dựa vào các chỉ

tiêu sau:

2.1. Xác định thời gian mọc của các VSV

Theo phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch bằng hoặc trong môi trường dung

dịch ( tùy từng giống vi sinh vật) ở tủ ổn định nhiệt độ 28 -60 0C ( tùy thuộc vào từng

đặc điểm của vi sinh vật).

Theo dõi ở từng thời gian khác nhau từ 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 giờ….

Từng thời gian trên quan sát khi VSV đã mọc được trong thời gian ni ở tủ ổn định

nhiệt, thì tính giờ. Xác định xem chủng giống đó thuộc nhóm mọc nhanh hay mọc

chậm)

2.2 Xác định kích thước khuẩn lạc đo trực tiếp bằng thước (mm)

Do nhiều khuẩn lạc sau đó tính trung bình trung ( tốt nhất ni 5 ngày mới đo)

2.3 Xác định kích thước tế bào bằng phương pháp đo trực tiếp bằng kính hiển vi

Cố định tiêu bản, nhuộm tế bào sau đó đo bằng dụng cụ đo chuyên dụng dưới kính

hiển vi

2.4. Xác định khả năng thích ứng ở mơi trường pH khác nhau

Bằng phương pháp nuôi cấy trực tiếp ở các mức pH khác nhau, cụ thể là:

pH = 4,0 ; pH = 5,0 ; pH = 6,0 ; pH = 7,0 ; pH = 8,0

Cách làm như sau:

- Pha dung dịch đệm Sorensen 1:

+ Cân chính xác 9,078 g KH2PO4 1/15 M.

+ Cân chính xác 11,876 g Na2HPO4. 2H2O hòa tan vào 1 lít nước cất được dung dịch

Na2HPO4 1/25 M.

Sau đó pha 2 dung dịch này theo tỉ lệ như sau : ( đối với 1000 ml môi trường).



47



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

pH

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0



Tỉ lệ trong dung dịch (ml)

Na2HPO4

KH2PO4

0

100

5

95

30

70

80

20

99

1



pH chính xác của mơi trường được tạo ra nhờ sự giúp đỡ của dung dịch đệm phophat

được bổ sung vào môi trường vô trùng với số lượng 10% so với thể tích của mơi

trường.

- Chuẩn bị mơi trường chun tính của các chủng vi sinh vật sau đó pha môi trường

với các nồng độ pH khác nhau, đem hấp khử trùng ( 1atm, 20 phút), đỗ ra đĩa

petri( 15- 20 ml/ 1 đĩa petri).

Thí nghiệm được nhắc lại 4 lần ở 5 mức pH khác nhau.

- Môi trường dịch thể được cho vào các bình tam giác 100 ml ( 50 ml mơi trường dịch

thể/ 1 bình tam giác). Cấy 1 ml dịch khuẩn chuyên tính của từng chủng vi sinh vật vào

các bình tam giác đã chuẩn bị ở trên rồi đưa lên máy lắc (150 vòng/ phút, trong vòng

48 giờ). Sau đó lấy 0,05 ml dịch vi khuẩn đó cấy vào mơi trường thạch bằng ( đã được

chuẩn bị ở trên), dùng que gạt ( đã khử trùng) gạt đều dịch vi khuẩn trên bề mặt thạch.

Sau đó đem ni trong tủ định ơn ( nhiệt độ từ 28- 30 0C). Sau 48 giờ nuôi cấy đưa ra

đếm số lượng khuẩn lạ ở từng nồng độ pH khác nhau.

2.5 Xác định khả năng kháng kháng sinh ( khả năng cạnh tranh)

Theo phương pháp nuôi cấy trực tiếp trên mơi trường có Streptomixin với các nồng độ

khác nhau : 300, 500, 600, 800, 1000 mg/1 lít mơi trường

Cách làm như sau:

Pha thuốc kháng sinh theo nồng đã định sẵn cho vào mơi trường chun tính của từng

chủng vi sinh vật ( môi trường đã được khử trùng ở 1 at, 30’). Sau đó chia ra các đĩa

petri rồi để nguội. Cấy 0,05 ml dịch khuẩn chuyên tính của từng chủng vi sinh vật đĩa

petri, đem nuôi trong tủ định ôn (nhiệt độ từ 28 – 300C). Sau 3 ngày nuôi cấy đưa ra

đếm và quan sát số lượng khuẩn lạc mọc ở từng nồng độ kháng sinh khác nhau.



MỤC LỤC



48



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Bài 3: PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CÁC LOẠI VI KHUẨN.

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×