Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
NUÔI CẤY VI SINH VẬT

NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Tải bản đầy đủ - 0trang

Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

- Với các ống nghiệm cũ đã bị nhiễm khuẩn :

+ Hấp trùng ở 1200C trong 30 phút.

+ Lấy ra và đổ các vật phẩm trong ống nghiệm đi.

+ Ngâm ống nghiệm vào nước ấm .

+ Rửa ống nghiệm bằng cách:

Dùng chổi chấm xà bông hay tro bếp cọ xát vào thành ống đều khắp nhiều lần.

Rửa nước 2- 3 lần.

Úp ống nghiệm cho thật ráo nước và khô.

Sấy khô ở 700C.

- Với các ống nghiệm không nhiễm khuẩn hay chứa các vi khuẩn khơng gây bệnh thì

khơng phải hấp khử trùng và tiến hành rửa như trên.

* Đĩa pêtri:

- Đặt ngữa đĩa petri trong lòng bàn tay trái.

- Tay phải dùng dẻ có chấm tro hoặc xà bơng xát vào 2 mặt của đĩa, các khe ở chân đĩa

và thành đĩa.

- Rửa nước 2 -3 lần.

- Úp nghiêng các đĩa trong giỏ nhựa cho thật khô.

* Các dụng cụ thủy tinh khác: phễu, chai lọ, bình cầu, bình tam giác.

- Dùng giẻ với nước xà bông cọ rửa phần ngoại dụng cụ.

- Dùng nước xà bông đặc lắc kĩ để rửa phần trong dụng cụ.

- Rửa nước nhiều lần cho sạch và để ráo.

* Nút ống cao su:

- Phân loại các dụng cụ này theo kích thước to, nhỏ, tốt, xấu, sạch hay bẩn.

- Ngâm từng loại riêng vào nước ấm ( 50 – 800C) trong 3- 4 h.

- Cọ rửa kĩ trong nước xà bông.

- Rửa nước lã nhiều lần.

- Phơi nắng 2 -3h rồi cất đi dùng dần.

2.1.1.2 Bao gói dụng cụ

1. Nguyên tắc

- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khơ.

- Việc bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự

vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng.

9



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

2. Phương pháp bao gói dụng cụ

Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:

- Làm nút bông : cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que gạt.

- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ thủy tinh.

2.1.1.3. Khử trùng dụng cụ

1. Nguyên tắc

- Sau khi khử trùng cần đảm bảo:

+ Sự vô trùng tuyệt đối cho các vật phẩm và các dụng cụ.

+ Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật.

2. Các phương pháp khử trùng

Khi khử trùng bằng nhiệt, các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật có thể bị tiêu diệt dễ

dàng trong các bào tử vẫn còn tồn tại ở ngay nhiệt độ đó.

Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào:

- Tính chất môi trường

- Số lượng tế bào

- Độ pH của vật định khử trùng.

Do vậy, để khử trùng bằng nhiệt có hiệu quả cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất

và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và các bào tử

của chúng có trong dụng cụ khử trùng.

2.1.2 Chuẩn bị mơi trường để nuôi cấy vi sinh vật

2.1.2.1 Môi trường dinh dưỡng

1. Khái niệm

- Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào.

- Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ

duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi

trường.

2. Các yêu cầu cơ bản của mơi trường dinh dưỡng

- Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết.

- Có độ pH thích hợp.

- Có độ nhớt nhất định.

- Khơng chứa các yếu tố độc hại.

- Hồn tồn vơ trùng.

10



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

3. Phân loại môi trường dinh dưỡng

Người ta dựa trên cơ sở khác nhau để phân loại môi trường.

a) Căn cứ theo thành phần và nguồn gốc: Có 3 loại mơi trường là:

- Mơi trường tự nhiên: Có thành phần mơi trường là các sản phẩm tự nhiên như sữa,

trứng, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám. Thành phần hóa học của loại mơi

trường này khơng được xác định chính xác do tính chất không ổn định của sản phẩm

tự nhiên.

- Môi trường tổng hợp: Là mơi trường gồm các chất hóa học mà thành phần của chúng

được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác.

- Mơi trường bán tổng hợp:Là mơi trường mà thành phần gồm cả hóa chất lẫn các chất

hữu cơ tự nhiên.

b) Căn cứ vào tính chất lý học: Có thể chia mơi trường thành 3 loại.

- Môi trường lỏng ( dịch thể):

Thành phần môi trường này không chứa thạch và thường được dùng để nghiên cứu

quá trình vi tổng hợp của vi sinh vật.

- Môi trường đặc:

Trong thành phần môi trường này chứa 1,5 -2% agar hoặc 10 -20% gelatin và dùng để

nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí của vi sinh vật.

- Môi trường bán lỏng:

Môi trường này chứa 0,35 – 0,7% agar.

c) Căn cứ vào cơng dụng : Có thể gồm các loại môi trường sau:

- Môi trường cơ bản: Thích hợp cho nhiều vi sinh vật khác nhau:

- Mơi trường chọn lọc: Là môi trường đảm bảo cho sự phát triển ưu thế của 1 lồi hay

một nhóm vi sinh vật xác định nào đó.

- Mơi trường kiểm định: Là môi trường cho phép phân biệt được một số đặc điểm của

một số loại vi khuẩn cần xác định. Thông thường người ta dùng chất chỉ thị màu hay

một số hóa chất để tạo ra những phản ứng màu đặc trưng.

Ví dụ: Mơi trường kiểm định kháng sinh, mơi trường lên men các loại đường.

4. Phương pháp làm môi trường

Làm môi trường để thực hiện được việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật,

đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng.

a) Nguyên tắc của việc chế tạo môi trường:

11



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh

dưỡng của từng loại vi sinh vật.

- Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật

nên cần điều chỉnh tỉ lệ và nồng độ các chát trong thành phần môi trường.

- Đảm bảo các điều kiện hóa lí cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh

vật.

b) Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng:

- Pha chế:

Cân, đong thật chính xác từng thành phần mơi trường và pha chế theo đúng trình tự

+ Mơi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi hòa tan vào nước .

+ Mơi trường đặc:

 Cân agar rồi ngâm vào nước.

 Cân hóa chất rồi hòa tan trong nước.

 Vớt agar ra, vắt khơ, bỏ vào xoong môi trường để đun.

- Làm trong môi trường:

Việc làm trong môi trường sẽ giúp dễ dàng quan sát sự phát triển của vi sinh vật, bao

gồm các bước sau:

+ Cách 1 : Lọc bằng bông, vải thưa hay giấy lọc

+ Cách 2: Lọc bằng lòng trắng trứng gà.

Cứ 1 lít mơi trường dùng lòng trắng trứng gà.Lấy lòng trắng trứng + lượng nước

bằng lượng lòng trắng đánh tan cho sủi bọt. Đỗ hỗn hợp dịch trứng và nước trên vào

môi trường.Trộn đều, đun sôi 10- 15 phút.Để lắng rồi mới lọc.

- Điều chỉnh độ pH của môi trường:

+ Người ta dùng HCl 10% hay NaCl 10%. Ngoài ra có thể dùng một số hóa chất khác

như H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3….

+ Sử dụng máy đo pH, và giấy quỳ để kiểm tra độ pH.

- Phân phối môi trường vào dụng cụ:

Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác. Trình

tự phân bố như sau:

+ Mơi trường cần được đun cho hóa lỏng rồi đổ qua phễu thủy tinh vào các dụng cụ.

+ Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường.

+ Tay phải kẹp nút bông và kéo ra.

12



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Mơi Trường

+ Nhanh tay rót mơi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại.

+ Chú ý:

 Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng mơi

trường phân phối chiếm ¼ thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng thì

lượng mơi trường cần được phân phối từ ½ - 1/3 thể tích ống nghiệm.

 Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng mơi trường được phân phối chiếm ½ 2/3 thể tích của bình.

 Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để mơi trường khơng dính lên

miệng dụng cụ hoặc các nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước

khi môi trường bị đông đặc.

- Khử trùng mơi trường:

Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại mơi trường mà có chế độ và

phương pháp khử trùng khác nhau.

Các phương pháp khử trùng thường sử dụng là: phương pháp Pasteur, phương pháp

Tyndal, phương pháp lọc bằng dụng cụ lọc vi khuẩn và phương pháp hấp hơi nước bão

hòa ở áp suất cao.

 Đối với các dụng cụ chịu nhiệt ( sứ, vải, thủy tinh) khử trùng ở 1,5 atm / 20 phút

-30 phút.

 Đối với dụng cụ chứa 1l môi trường trở lên thì hấp ở 1atm/30 phút.

 Với các loại mơi trường chứa đường dễ bị biến chất ở nhiệt độ cao thì hấp khử

trùng ở 0,5 – 0,6 atm/15 phút.

- Làm thạch nghiêng, thách đứng, đổ thạch vào đĩa Pêtri:

+ Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết

thúc và môi trường chưa đông đặc.

 Đặt ống nghiệm có mơi trường lên giá đặt nghiêng, nhưng không được để môi

trường chạm vào nút bông.

 Để yên cho đến khi mặt thạch đông đặc, yêu cầu mặt thạch phải thẳng, nhẵn liên

tục.

+ Làm thạch đứng: Đặt các ống nghiệm đã có mơi trường làm thạch đứng vào giá,

để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc.

+ Đổ thạch vào đĩa pêtri:

13



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Mơi Trường

Tồn bộ quy trình đỗ thạch vào đĩa pêtri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng và

gồm các thao tác sau:

 Mở bao giấy gói các đĩa pêtri.

 Tay phải cầm dụng cụ (bình tam giác) chứa mơi trường.

 Tay trái lấy nút bơng ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn cồn.

 Nghiêng bình và rót nhẹ một chút mơi trường vào đĩa pêtri sau khi tay trái mở hé

nắp trên của đĩa.

 Đậy nắp trên lại, xoay tròn đĩa pêtri để môi trường được phân phối đều trên mặt

đĩa.

 Để yên cho môi trường nguội và đông đặc

 Lật ngược cho đáy dưới của đĩa pêtri lên trên để hơi nước bốc ra và khô dần đi.

+ Chú ý:

 Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm bẩn.

 Mặt thạch phải thẳng, nhẵn có độ dày khoảng 2mm. Thơng thường cứ ¼ lit mơi

trường có thể phân phối được 22 – 25 đĩa pêtri.

 Sau khi đổ môi trường vào đĩa pêtri, 1 - 2 ngày sau khi kiểm tra lại xem mơi

trường có bị nhiễm khuẩn khơng rồi mới sử dụng để cấy hay phân lập.

 Nhớ viết vào nhãn: Tên môi trường …

Khử trùng: ngày … tháng … năm

 Để vào nơi cất giữ môi trường để tiện cho việc theo dõi, sử dụng và bảo quản.

- Bảo quản và kiểm tra môi trường:

+ Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh

sáng, nhiệt độ từ 0 – 5oC và không để môi trường bị khô.

+ Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt

chúng vào tủ ẩm 37oC, trong 48 – 72 giờ. Sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống có

vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa pêtri có mơi

trường đạt u cầu.

2.1.2.2. Công thức và cách chế tạo một số môi trường thông dụng

1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

a) Môi trường nước thịt – pepton

- Công thức:

14



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

Nước chiết thịt :

Pepton



10g



NaCl



5g



1000ml



- Cách chế tạo nước thịt:

+ Thịt bò tươi lọc sạch gân, mỡ, đem xay hoặc thái nhỏ. Cứ 500g thịt thêm 1000 ml

nước.

+ Đun nóng từ từ giữ ở 50oC trong vòng 1 giờ, sau đó đun sơi 30 phút.

+ Để nguội và lắng trong dung dịch.

+ Lọc bằng vải hay giấy lọc.

+ Phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng.

b) Môi trường nước mắm – peptôn:

- Công thức :

Nước mắm 350 đạm 30 ml

Pepton



10 g



Nước cất bổ sung đến 1000ml

pH = 7, khử trùng 1 atm/ 30 phút.

- Cách chế tạo hỗn dịch ( thạch + nước thịt + peptôn)

+ Cho 10 g peptôn vào nước thịt.

+ Thạch cân xong, ngâm nước, rữa kĩ, để ráo.

+ Cho thạch vào dung dịch nước thịt – peptôn.

+ Đun sôi cho tan và để nguội 450C.

+ Điều chỉnh độ pH rồi mới lọc.

2. Môi trường nuôi cấy nấm men.

a) Mơi trường khoai tây – đường cám:

Khoai tây



300g



Cám



100g



Đường kính

Nước



50 g

1000ml



- Cách chế tạo:

+ Khoai tây gọt vỏ, rửa, cân 300g, thái nhỏ hạt lựu. Thêm 500 ml nước rồi đun sôi

30 phút.

+ Lọc lấy nước trong.

15



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

+ Cân 100g cám đun sôi với 500 ml nước trong 30 phút rồi lọc trong.

+ Trộn 2 dịch lọc trên với nhau và thêm 50 g đường.

+ Bổ sung nước cho đủ 1000ml.

+ Nếu làm môi trường đặc thêm 20 g cám.

Chú ý: cũng có thể khơng dùng cám.

b) Mơi trường giá đậu - đường:

Cân 100 g giá đậu: Thêm 100 ml nước. Đun sôi 30 phút. Lọc lấy dịch trong. Bổ

sung nước cho đủ 1000ml và thêm 50 g đường. Nếu làm môi trường đặc thì thêm

20 g thạch. Phân phối mơi trường rồi khử trùng.

3. Môi trường nuôi cấy nấm mốc

a) Môi trường peptơn – glucoza:

Có thể dùng mơi trường này để kiểm tra số lượng tế bào nấm mốc ở trong đất.

Glucôza



10g



Peptôn



5g



K2HPO4



1g



MgSO4. 7H2O 0,5 g

Nước cất



1000 ml



Thạch ( agar)



20 g



pH = 4, sau khi khử trùng.

b) Môi trường cơm rượu:

Cơm



10g



Axit lactic (1%) 40 ml

Nước cất



15 ml



Rượu (500)



12,5 ml.



- Cách chế tạo:

+ Cho cơm, axit lactic, nước cất vào bình tam giác.

+ Khử trùng ở 1 atm /15 phút.

+ Lấy ra để nguội mới cho rượu vào.

2.2 Nuôi cấy vi sinh vật

2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật

1. Nguyên tắc:

- Tách rời các tế bào vi sinh vật.

16



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

- Nuôi cấy các tế bào trên trong môi truờng dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc

riêng rẽ, cách biệt nhau.

2. Qúa trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết

Với hầu hết các mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết

bao gồm các bước sau:

- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu.

- Phân lập vi sinh vật thuần khiết.

- Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc.

a) Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẻ trên các môi trường phân lập:

- Nếu mẫu ban đầu ở dạng đặc phải đưa về dạng lỏng bằng cách

+ Nghiền mẫu

+ Hòa tan mẫu trong nước cất vơ trùng.

Sau thực hiện như dạng mẫu lỏng.

+ Tiếp tục pha loãng ở nồng độ cần thiết.

+ Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó.

- Chú ý: Nếu khơng có mơi trường đặc trưng có thể sử dụng mơi trường mà vi sinh vật

cần phân lập phát triển bình thưòng ( có thể bổ sung các chất ức chế các loại vi sinh

vật khác).

b) Phân lập các vi sinh vật trên môi trường đặc ở đĩa petri

- Đối với vi sinh vật hiếu khí.

+ Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha lỗng cho vào đĩa pêtri có mơi trường thích hợp .

+ Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.

+ Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ 2 rồi dĩa

thứ 3.

+ Đặt các đĩa pêtri 1, 2,3 trên vào các tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp, sau một thời gian

nhất định tùy vào giống vi sinh vật ta sẽ có được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa thứ

2 và 3

- Đối với vi sinh vật kị khí.

+ Dùng mơi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thủy để loại bỏ khơng khí

trong mơi trường.

+ Để nguội mơi trường còn 450 – 500C.



17



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

+ Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại , lắc tròn quanh trục

ống nghiệm.

+ Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật nhanh

nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và mơi trường khơng còn khơng khí.

+ Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa pêtri và ủ ở nhiệt độ thích

hợp.

+ Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường,

dùng que cấy cắt cả khối mơi trường rồi cấy vào mơi trường lỏng thích hợp.

c) Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập:

Có nhiều cách kiểm tra:

- Kiểm tra vết cấy:

Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên mơi trườg đặc.

+ Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập

tinh khiết thì giữ lại.

+ Nếu vết cấy khơng thuần nhất thì loại bỏ.

- Kiểm tra lại độ thuầm khiết của các khuẩn lạc:

+ Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng.

+ Tách các khuẩn lạc này ra và hòa tan, pha lỗng ở nồng độ cần thiết trong nước cất

vô trùng.

+ Nhỏ một giọt dịch trên vào đĩa pêtri có mơi trường.

+ Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, rồi đĩa thứ

2, thứ 3.

+ Đặt các đĩa pêtri trên vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy loại vi sinh

vật.

+ Sau lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện

thuần khiết của giống.

3) Phân lập một số giống vi sinh vật trong thực tế

a) Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis:

- Cỏ khô cắt nhỏ, cho vào 1 bình tam giác

- Bổ sung thêm : + Một chút phân

+ Nước sạch đổ ngập cỏ.

- Đun sôi 15 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng và các tế bào kháng sinh bào tử.

18



Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

- Đậy nút bông, để tủ ấm ở nhiệt độ 25- 260C trong 48- 72 h.

- Kết quả:

Xuất hiện các lớp váng xám có nhiều vi khuẩn Bacillus subtilis vì cỏ khơ bao giờ cũng

có bào tử của vi khuẩn này.

+ Trên kính hiển vi: Tế bào Bacillus subtilis có hình que, dài, bào tử hình ơvan nằm ở

xa tâm hay gần tâm khuẩn lạc. Tế bào có kích thước ( 3 -5 x0,6) m.



b) Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Mucor

- Có thể phân lập nấm mốc này trên cơm nguội, xơi làm mốc tương, bánh mì để khơ ít

ngày.

19



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×