Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

dinitro salysilic axit, BSA (Bovine serum albumin), Coomassie brilliant blueR250 (CBB-R250).

+ Các hố chất thơng dụng khác được mua của Trung Quốc và Việt

Nam: KNO3, KH2PO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, CH3COONa, HCl,

H2SO4, HNO3, C2H5OH, Agar (thạch)...

Các hoá chất trên đều tinh sạch ở mức độ phõn tích.

+ Bã sắn, cám con cò, cám ngơ mua từ cửa hàng thức ăn gia súc.

2.1.4 Thiết bị

- Tủ ấm, tủ sấy (Binder, Đức)

- Máy li tõm (Sorvall, Mỹ)

- Nồi hấp thanh trùng (Tommy, Nhật)

- Quang phổ kế (UV-vis, Shimazdu Nhật)

- Máy lắc ổn nhiệt (BR300LF và Memmert, Đức)

- Máy đo pH (MP 200R, Thụy Sỹ)

- Cõn phõn tích (Precisa XT 320M, Thụy Sỹ)

- Máy cất nước hai lần (Hamilton, Anh)

- Máy lọc nước siêu sạch (Millipore, Mỹ)

- Máy Vortex (Kika, Đức)

- Máy đo chất lượng nước (31 chỉ tiêu- Aqualytic, Đức)

- Micropipet (Gilson, Pháp) các loại từ 20àl – 10ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Hoạt hoỏ cỏc vi sinh vật [15]

- Đối với vi khuẩn: Các vi khuẩn bảo quản trong mơi trường thạch

nghiêng thích hợp cho mỗi loại ở 40C hoặc ở 200C. Trước khi sử dụng, các vi

khuẩn được hoạt hố trên mơi trường dịch thể, ni lắc các ống nghiệm

trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ, sau đó cấy trải trên mơi trường thạch đĩa để



26



tạo thành những khuẩn lạc mọc riêng rẽ, cấy truyền sang ống nghiệm chứa

các môi trường thạch. Sử dụng giống đã được hoạt hoá cho những nghiên

cứu tiếp theo.

- Đối với nấm mốc: Để có thể hoạt hố nấm mốc phương pháp làm

tương tự như đối với các vi khuẩn nhưng môi trường sử dụng là môi trường

MT1 và MT3.

2.2.1.2 Phương pháp lên men bề mặt [24]

Môi trường cơ chất bã sắn đã được làm ẩm đến 75% bằng dịch khoáng

và được thanh trùng ở 1210C, 1 atm trong 30 phút. Để nguội, bổ sung A.

oryzae NM1 và trộn đều nhằm phõn tán bào tử trong sinh khối lên men. Hỗn

hợp cơ chõt - giống được ủ trong 36h ở điều kiện 330C.

2.2.2 Phương pháp hoá sinh

2.2.2.1 Xác định khả năng sinh enzyme (amylase, cellulase, chitinase,

protease) bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.

Dựa theo phương pháp của Williams, (1983) [14, 59].

* Chuẩn bị cơ chất cho từng loại enzyme: Mơi trường gồm 2% thạch

có bổ sung 1% tinh bột tan hoặc 1% chitin hoặc 0.5% CMC hoặc 1% gelatin.

Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, đổ vào các đĩa petri, mỗi đĩa khoảng

25ml sau đó để nguội.

* Chuẩn bị dịch thử enzyme: Bã sắn trồng nấm sò và nấm linh chi sau

khi thu hái quả thể đem nghiền với nước bằng máy nghiền đồng thể tỉ lệ 1g cơ

chất/5 ml nước, lọc bỏ sợi bằng giấy lọc, li tâm thu dịch trong để thử hoạt tính.

* Thử hoạt tính: Dùng khoan nút chai khoan 2 lỗ trên đĩa thạch. Nhỏ

100àl dịch trong thu được vào mỗi lỗ. Đặt vào tủ lạnh 4 0C từ 8 -12h để

enzyme khuếch tán vào thạch, sau đó chuyển sang tủ ấm 30 0C khoảng 24h.

Hoạt tính enzyme được hiện hình bằng vòng phân giải khi sử dụng các

thuốc thử tương ứng. Hoạt tớnh Amylase và chitinase được hiện hình bằng



27



dung dịch lugol (1g KI với 2g I2 trong 300ml nước). Hoạt tớnh cellulase

được hiện hình bằng dung dịch cơng gơ đỏ 1%. Hoạt tớnh Protease được

hiện hình bằng dung dịch Amonisunfat bóo hồ. Hoạt tớnh các enzyme được

đánh giá sơ bộ bằng độ lớn vòng phõn giải (D-d, mm), trong đó D là đường

kớnh vòng phõn giải, d là đường kớnh lỗ thạch.

2.2.2.2 Xác định hoạt độ cacboxymethylcellulase và amylase

Dựa theo phương pháp của Miller G.L. (1959) [49].

* Nguyên lý: CMC-ase phõn cắt cacboxymethylcellulase (CMC) và

amylase phõn cắt tinh bột thành các oligosaccharide và glucose có tớnh khử

có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng.

* Tiến hành thí nghiệm:

+Pha dung dịch cơ chất: dung dịch 0,5% CMC hoặc dung dịch 1% tinh bột

ngô trong đệm 50mM Na-acetat, pH 5,5.

+ Dung dịch thuốc thử DNS: Hoà tan 2g phenol và 10g NaOH trong

300ml nước cất, sau đó thêm tiếp 0,5g Na 2SO3, 200g KNaC 4H4O6.4H2O,

10g DNS, khuấy đều cho cỏc hoỏ chất tan hoàn toàn. Bổ sung thêm nước

cất để đạt 1000 ml.

+ Dựng đường chuẩn D-glucose: Pha dung dịch gốc 10μmol/ml D-glucose

trong đệm 50mM Na-acetat. Từ đó pha loóng thành các nồng độ 0; 2; 4; 6;

10 (μmol/ml). Lấy 50μl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên + 450μl dịch

0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750μl dịch thuốc thử DNS. Đun cách

thuỷ trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng λ540nm.

Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá

trị OD được xõy dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-1)



28



Hình 2-1. Đường chuẩn xác định hàm lượng D-glucose bằng DNS

Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-glucose và

giá trị OD540nm thu được là y=15,759x + 0,15181. Trong đó: y là hàm lượng

D-glucose trong 1ml dịch; x là giá trị OD 540nm tương ứng. Hệ số tương quan

R2 = 0,9912 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.

+ Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của CMC-ase và amylase:

- Thí nghiệm: 450μl dung dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngơ) + 50μl

dịch enzyme đã pha lng thích hợp. Ủ ở 50 oC trong 30 phút, sau đó bổ sung

750μl dung dịch DNS để dừng phản ứng

- Đối chứng: 450μl dung dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750μl

dung dịch DNS + 50μl dịch enzyme đã pha loóng thích hợp. Ủ ở 50 oC trong

30 phút.

Đun cách thuỷ mẫu thí nghiệm và đối chứng trong 5-7 phút, để nguội

đến nhiệt độ phòng. Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ 540nm. Từ giá trị OD ta tớnh

được lượng đường khử được tạo ra nhờ đường chuẩn theo phương trình

y=15,759x + 0,15181 (trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong 1ml dịch; x

là giá trị OD540nm tương ứng).

Quy ước: Một đơn vị hoạt tớnh (IU) của CMC-ase (hoặc amylase là

lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1μmol đường khử trong 1 phút ở điều

kiện thí nghiệm dùng glucose là đường chuẩn.



29



2.2.2.3 Xác định hoạt độ xylanase

Dựa theo phương pháp của Bailey (1992) [31].

* Nguyên lý: Xylanase (endoxylanase 1,4- xylanase) phõn cắt cơ chất

xylan thành các oligoxylose và các xylose có tớnh khử, có khả năng bắt màu

vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng.

* Tiến hành thí nghiệm:

+ Dung dịch cơ chất 1% oat spelts xylan (OSX): Cõn 1gam OSX pha trong

đệm 50mM Na-acetat, pH 5,5.

+ Dung dịch thuốc thử DNS được pha như đã trình bày ở trên.

+ Dựng đường chuẩn D-xylose: Pha dung dịch gốc 10àmol/ml D- xylose

trong đệm Na-acetat 50mM. Từ đó pha loãng thành các nồng độ (àmol/ml):

0; 2; 4; 6; 8 ;10. Dựng 50àl dịch D-xylose ở các nồng độ + 450 àl dung dịch

1% oat spelts xylan (OSX) + 750àl dịch thử DNS. Đun cách thủy 5 phút, làm

lạnh đến nhiệt độ phòng và đo độ hấp phụ OD ở bước sóng



λ540nm



ta được giá



trị tương ứng.

Đường chuẩn thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ D- xylose và giá trị

OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-2)



Hình 2-2. Đường chuẩn D-xylose (Theo phương pháp DNS)

Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-xylose và

giá trị OD540nm thu được là y=11.653x+0.197. Trong đó: y là hàm lượng D-



30



xylose trong 1ml dịch; x là giá trị OD540nm tương ứng. Hệ số tương quan R 2 =

0,995 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.

* Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của xylanase

+ Thí nghiệm: 450àl dung dịch 1% OSX+ 50àl dịch enzyme đã pha lỗng

thích hợp. Ủ ở 500C trong 5 phút, bổ sung 750àl dung dịch DNS để dừng phản

ứng.

+ Đối chứng: 450àl dung dịch 1% OSX+ 750àl dung dịch DNS+ 50àl dịch

enzyme đã pha lỗng thích hợp. Ủ ở 500C trong 5 phút.

Đun cách thủy mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng trong 5 đến 7 phút,

sau đó cho qua nước lạnh. Đo độ hấp phụ ở bước sóng 540nm. Từ giá trị OD

ta tính được lượng đường khử được tạo ra nhờ phương trình

y=11.653x+0.197 (trong đó: y là hàm lượng D-xylose trong 1ml dịch; x là

giá trị OD540nm tương ứng).

Qui ước: Một đơn vị hoạt độ xylanase (IU) là lượng enzyme cần thiết

để giải phóng 1 àmol đường khử trong một phút ở điều kiện thí nghiệm dùng

xylose là đường chuẩn.

2.2.2.4 Hoạt tính Protease

Dựa theo phương pháp của: Folin, O., and Ciocalteu, V., (1929) [58].

* Nguyên lý: Dựa trên sự bắt màu xanh tớm đặc trưng của amino acid

khi có mặt của thuốc thử Folin-Ciocalteu ,s Phenol, hấp thụ tốt nhất ở bước

sóng 660nm.

* Tiến hành thí nghiệm:

+ Chuẩn bị hoá chất:

1. Đệm Phosphate 50mM, pH=7.5

2. Dung dịch casein 0,65% trong 50mM đệm Phosphate: Cân 0,65g casein

vào 100ml dung dịch đệm trên, đun nóng nhẹ đến 80-90 0C trong 10 phút và

khuấy cho tan (chỉnh pH 7,5 bằng NaOH 1M và HCl 1M).



31



3. Axit tricloacetic 110mM. Pha dung dịch TCA 6,1N (9,967g TCA/10ml

nước cất siêu sạch), lấy 9ml TCA 6,1N pha với nước siêu sạch thành 500ml.

4. Dung dịch thuốc thử Folin và Ciocateu ,s phenol. Pha loãng Folin và

Ciocateu,s phenol với nước cất siêu sạch theo tỉ lệ 1:3.

5. Na2CO3 500mM : Cân 53g Na2CO3 trong 1000ml nước siêu sạch

6. Đệm acetat natri 10mM, acetat canxi 5mM: Cân 0,82g acetat natri +0,79

acetat canxi trong 1000ml nước siêu sạch (chỉnh pH 7,5 bằng NaOH 0,1M,

CH3COOH 0,1M).

7. L-Tyrosine 1μmol/ml: cõn 1,81mg tyrosine pha trong 10ml nước siêu

sạch, dùng máy khuấy từ khuấy đều cho tan.

+ Dựng đường chuẩn L-Tyrosine: Pha dung dịch gốc 1μmol/ml L-Tyrosine

trong đệm 50mM Phosphate. Từ đó pha loóng thành các nồng độ 0.01; 0.02;

0.04; 0.06; 0.08; 0.1; 0.12; 0.14; 0.16; 0.18; 0.2 (μmol/ml). Lấy 400μl

Tyrosine + 1000μl Na2CO3 + 200μl Folin. Ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng

trong 10 phút. Đo ở bước sóng λ660nm.

Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ L-Tyrosine và giá

trị OD được xõy dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-3)



Hình 2-3. Đường chuẩn thể hiện mối tương giữa OD660 và hàm

lượng Tyrosine



32



Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng L-Tyrosine và

giá trị OD660nm thu được là y=0.3536-0.0018. Trong đó: y là hàm lượng LTyrosine trong 1ml dịch; x là giá trị OD660nm tương ứng. Hệ số tương quan R 2

= 0,9971 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.

* Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của Protease:



+ Thí nghiệm: 250μl dung dịch 0,65% casein + 50μl dịch enzyme đã pha

loãng phù hợp. Ủ ở 500C trong 30 phút, bổ sung 250àl dung dịch TCA để

dừng phản ứng.

+ Đối chứng: 250μl dung dịch 0,65% casein + 250àl dung dịch TCA +50μl

dịch enzyme đã pha loãng phù hợp. Ủ ở 500C trong 30 phút.

Li tâm mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng 10000 v/phỳt trong 5 phút.

Lấy 400μl dịch li tâm + 1ml Na 2CO3 500mM + 200μl Folin. Ủ 5-10phút, đo

OD660. Từ giá trị OD ta tính được lượng enzyme (IU/ml) được tạo ra nhờ

phương trình y=0.3536-0.0018 (trong đó: y là hàm lượng L-Tyrosine trong

1ml dịch; x là giá trị OD660nm tương ứng).

Qui ước: : Một đơn vị hoạt tính protease (IU) là lượng enzym cần

thiết để giải phóng 1 àmol acid amin (tớnh theo L-Tyrosine) trong một phút

ở điều kiện thí nghiệm.

2.2.2.5 Xác định hoạt tính kháng sinh

Dựa theo phương pháp của Egorov et al., (1969).

* Chuẩn bị vi sinh vật kiểm định: Nuụi cỏc vi sinh vật kiểm định B.

subtilis, E.coli, Staphyllococcus sp., S. aureus 7YB, S. enteritidis,



S.



typhymurium trên mơi trường MPA dịch thể.

* Chuẩn bị dịch trích ly từ hệ sợi của nấm: Bã sắn trồng nấm sò và

nấm linh chi sau khi thu hái quả thể đem nghiền với nước bằng máy nghiền

đồng thể tỉ lệ 1g cơ chất/5 ml nước, lọc bỏ sợi bằng giấy lọc, li tâm thu dịch

trong để thử hoạt tính.



33



* Thử hoạt tớnh kháng sinh: Trộn vi sinh vật kiểm định vào mơi

trường MPA thạch nóng chảy ở 40- 500C, đổ vào đĩa petri, để nguội. Dùng

khoan nút chai (= 8mm) khoan 4 lỗ trên đĩa thạch. Nhỏ 100àl dịch trích ly

từ hệ sợi của nấm vào lỗ thạch. Để đĩa petri vào tủ lạnh 4 0C từ 8h-12h cho

dịch nấm khuếch tán vào thạch, sau đó ni trong tủ ấm 30 0C trong 24h.

Hoạt tính kháng sinh được đánh giá bằng độ lớn vòng vơ khuẩn (D-d, mm),

trong đó D là đường kớnh vòng vơ khuẩn, d là đường kớnh lỗ thạch.

2.2.2.6 Phương pháp xác định Protein tổng số

Dựa theo phương pháp của Bradford (1976) [34]

*Nguyên lý: Phương pháp dựa trên sự bắt màu của protein khi có mặt

của dịch nhuộm Bradford (thành phần chớnh là Coomassie Brilliant Blue G250 (CBB-250) có tớnh bám đặc hiệu đối với các amino acid trên bề mặt

các phõn tử protein cần phõn tích. Các phõn tử thuốc thử có chứa 6 nhúm

phenyl và 2 nhúm acid sulfuric. Do đó, các tương tác chủ yếu xảy ra với các

đuôi kị nước (tryptophan, tyrosine, histidine và phenylalanine), tích điện õm

(arginine, lysine) và là các liên kết yếu hoặc khơng đồng hố trị.

* Tiến hành thí nghiệm:

- Dung dịch Bradford: Pha 50mg Coomassie Brilliant Blue G-250 trong

25ml dung dịch 95% ethanol, bổ sung thêm 50 ml dung dịch 85% H 3PO4

(w/v). Rót dung dịch trên vào bình chứa và bổ sung thêm nước khử ion cho

đến khi đạt 500ml thì dừng lại, lọc qua giấy lọc Whatman và giữ trong lọ màu

ở tủ lạnh 40C.

- Dung dịch BSA (1mg/ml): Pha dung dịch BSA trong nước khử ion, giữ

trong điều kiện lạnh âm để bảo quản.

- Tiến hành dựng đường chuẩn BSA

- Bước 1: Chuẩn bị dung dịch thuốc thử như hướng dẫn nêu trên

- Bước 2: Chuẩn bị dung dịch BSA hàm lượng 0,1mg/ml bằng cách pha

loãng 10 lần dung dịch mẹ đã chuẩn bị với H2O khử ion.

34



- Bước 3: Tiến hành xây dựng đường chuẩn theo bảng sau:



Mẫu thử

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0



Thể tích dung dịch BSA

(μl)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100



Thể tích H20 μl

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0



Thể tích thuốc thử

Braford (μl)

1000

1000

1000

1000

1000

1000

1000

1000

1000

1000

1000



- Bước 4: Ủ trong điều kiện phòng 15- 20 phút

- Bước 5: Đo độ hấp thụ ở 595 trên máy quang phổ Photometric UV.

Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ BSA (μg/ml) và

giá trị OD595 được xõy dựng trên chương trình Microsoft Excel (Hình 2-4).



Hình 2-4. Đồ thị chuẩn BSA

Từ đồ thị trên ta có phương trình đường chuẩn y= 23,184x-0,4094, với

y là lượng BSA có trong 1ml dịch, x là giá trị OD595 tương ứng. Hệ số tương

quan R2=0,9944 chứng tỏ mối liên hệ giữa y và x là chặt chẽ.



35



- Thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm bằng cách lấy 100μl dung dịch protờin cần kiểm tra (đã

pha loãng phù hợp) và bổ sung thêm 1000μl thuốc thử Bradford. Ủ trong 1520 phút ở điều kiện phòng, đo độ hấp phụ ở 595nm. Hàm lượng protờin được

xác định theo phương trình y= 23,184x-0,4094 ở trên.

2.2.2.7 Phương pháp xác định lượng đường tổng số

Dựa theo phương pháp phenol-acid-sulfuric của Dubois và cs. (1956)

[47].

* Nguyên lý: Các loại đường đơn, oligosaccharide và dẫn xuất của

chúng (bao gồm cả các ete methyl) không hoặc có các nhúm có tớnh khử, sẽ

tạo ra màu vàng cam khi xử lý bằng phenol và H 2SO4 đặc. Phản ứng này rất

nhạy cảm và màu sắc bền.

* Tiến hành thí nghiệm

- Dung dịch 5% phenol: Làm tan phenol ở 50 0C và bổ sung 5ml phenol lỏng

vào 95ml H2O.

- Dung dịch H2SO4 đậm đặc.

- Dung dịch gốc 10àmol/ml D-xylose, sau đó pha loóng thành các nồng độ

0,2 đến 2,0 àmol/ml.

- Tiến hành dựng đường chuẩn D-xylose: Lấy 0,5ml mỗi nồng độ D-xylose,

sau đó bổ sung lần lượt 0,5ml dung dịch 5% phenol, 2,5ml H 2SO4 đậm đặc.

Trộn đều và giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Đo ở bước sóng 490nm thu

được các giá trị OD tương ứng.

Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ D-xylose với giá

trị OD được xây dựng nhờ chương trình Excel (Hình 2-5)



36



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×