Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Rèn các kỹ năng thực hành:

Rèn các kỹ năng thực hành:

Tải bản đầy đủ - 0trang

+ Ở tinh bột, liên kết giữa các phân tử glucose ở amylose (thành phần

tạo phản ứng màu với I2 trong thuốc thử Lugol) là α–1,4-glycosid, trong

khi ở amylopectin là α–1,4-glycosid (mạch thẳng) và α–1,6-glycosid (vị trí

phân nhánh).

+ Ống A và B: α–amylase nước bọt thủy phân liên kết α–1,4-glycosid

ở amylose của tinh bột thành các dextrin từ lớn đến nhỏ, cuối cùng là

glucose, trong khi sucrase không thủy phân được tinh bột, do đó ống A cho

màu vàng (hoặc đỏ vàng, đỏ nâu tùy độ mạnh của α–amylase) với thuốc

thử Lugol (âm tính), trong khi ống B cho màu xanh tím (dương tính).

+ Ống C và D: sucrase khơng thủy phân được tinh bột, nhưng thủy

phân liên kết α–1,2-glycosid của đường sucrose tạo thành đường glucose

có tính khử, do đó ống C âm tính với thuốc thử Fehling, còn ống D xuất

hiện kết tủa Cu2O đỏ gạch.

B. Ảnh hưởng nhiệt độ, pH, các chất kìm hãm lên hoạt độ của enzyme

Ảnh hưởng của nhiệt độ

+ Các enzyme tách từ cơ thể động vật máu nóng hoạt động mạnh nhất

ở 37–400C, ngoài giới hạn này hoạt độ đều giảm, đặc biệt khi đun nóng

trên 700C các enzyme đều bị bất hoạt hồn tồn.

+ Do đó nếu tinh bột khơng bị thủy phân sẽ tạo phức màu xanh tím

với iod trong thuốc thử Lugol.

+ Nếu tinh bột bị thủy phân dần thành các dextrin từ lớn đến nhỏ, sẽ

không tạo thành phức màu tím với iod trong thuốc thử Lugol.

Ảnh hưởng của pH môi trường

+ Mỗi enzyme hoạt động mạnh nhất ở một pH nhất định, ở các pH

khác hoạt độ enzyme giảm.

+ pH thích hợp cho hoạt độ của enzyme α–amylase nước bọt ở vùng

trung tính (gần 7) do đó trong khoảng này (6,8–7,2), tinh bột bị thủy phân

sẽ cho phản ứng âm với thuốc thử Lugol.

Ảnh hưởng của các chất kích thích và kìm hãm



51



+ Các ion kim loại nặng, kim loại trung bình (như Cu 2+) có tác dụng

kìm hãm hoạt độ của α–amylase nước bọt, trong khi các ion kim loại kiềm

(như Na+) có tác dụng kích thích hoạt độ α–amylase nước bọt.

C. Xác định hoạt độ của một số enzyme

Xác định hoạt độ của catalase

– Nguyên tắc:

+ Catalase là enzyme xúc tác cho phản ứng:

2H2O2 → O2 + 2H2O



(1)



+ Ta định lượng catalase bằng KMnO 4 để xác định lượng H2O2 trước

và sau khi enzyme tác dụng theo phương trình phản ứng:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O (2)

+ Số mg H2O2 bị phân giải bởi enzyme trong 1g khoai tây (X):

Trong đó:

A, B – thể tích KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ H2O2 trong bình A, B.

V1, V2 – thể tích enzyme ban đầu và lấy để xác định.

a – Số gam nguyên liệu lấy nghiên cứu.

1,7 – Hệ số phản ứng tính theo H2O2 tính theo phản ứng (2)

+ Số đơn vị catalase trong 1g khoai tây trên 1 micromol H 2O2 bị phân

giải sau 1 phút:

Trong đó:

30 – Thời gian enzyme tác dụng

0,034 – Khối lượng 1μmol H2O2

+ Trong thí nghiệm này sử dụng phương pháp chuẩn độ ngược, dùng

dung dịch KMnO4 0,1N để xác định lượng H2O2 trước và sau khi enzyme

tác dụng, từ đó tính được lượng H2O2 đã bị phân giải

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O

Chuẩn độ cho tới khi xuất hiện màu hồng bền chính là màu KMnO4 dư.

+ Bình thí nghiệm cho enzyme tác dụng, còn bình đối chứng với

enzyme bị bất hoạt, khơng xảy ra phản ứng phân giải H2O2

Xác định hoạt độ của urease

52



– Nguyên tắc: Dùng phương pháp chuẩn độ để xác định lượng NH 3

được tạo thành từ urea dưới tác dụng của urease.

+ 1ml HCl 0,1N tương ứng với 1,4mg N 2. Hoạt độ urease được giải

phóng từ urea dưới tác dụng của urea có trong lượng dung dịch enzyme đã

dùng trong 1 phút và được tính theo cơng thức:

Trong đó:

A, B – Thể tích HCl 0,1N đã dùng để chuẩn độ bình A, B

30 – Thời gian phản ứng (phút)

1,4 – Hệ số chuyển thành nitr

+ Hoạt độ của nguyên liệu ban đầu (trên 1g mẫu):

Trong đó:

V1, V2 – Thể tích dung dịch enzyme thu được và xác định hoạt độ.

m – Khối lượng bột chiết để tách enzyme

III. THIẾT BỊ – HÓA CHẤT- MẪU VẬT

1. Dụng cụ

+ Ống nghiệm, pipet, bình nón, buret, bình định mức, cốc đong, ống

đong, đũa thủy inh

+ Giá đựng ống nghiệm, kẹp gỗ, giá đỡ buret

+ Bản sứ 6 giếng, cối chày sứ

+ Giấy lọc, phễu lọc Buchner, giấy quỳ, giấy sắc ký, giấy thấm, bông

+ Đèn cồn

2. Thiết bị

+ Bếp điện, tủ ấm 370C, tủ lạnh, nồi cách thủy

+ Máy đo pH, đồng hồ, cân hóa chất, máy hút chân khơng, máy ly tâm

3. Nguyên liệu, hóa chất, mẫu vật

+ Khoai tây, đậu tương, bột CaCO3

+ Dung dịch tinh bột, sacaroza, sacaroza nấm men

+ Dung dịch urea, Pb(CH3COO)2, KMnO4, H2O2 trong đệm

phosphate, NaCl, CuSO4, Na2HPO4, KH2PO4,

+ Dung dịch HCl đặc, H2SO4 đặc

53



+ Giấy quỳ tím, phenol phtalein, thuốc thử Lugol, thuốc thử Fehling

+ Acetamit.

IV. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. Tính đặc hiệu của enzyme

1.1.Tính đặc hiệu của urease

– Chuẩn bị:

+ Urease (bột đậu tương), dung dịch urea 5%, dung dịch acetamit 5%

+ Ống nghiệm, pipet, giấy quỳ, nút bấc ống nghiệm, tủ ấm 370C

– Tiến hành:

+ Lấy 2 ống nghiệm sạch, cho vào ống A: 4ml urea 5%, ống B: 4ml

acetamit 5%

+ Thêm vào mỗi ống 1g bột đậu tương, lắc đều.

+ Đặt trên miệng mỗi ống một mẩu giấy quỳ, đậy miệng 2 ống bằng

nút bấc

+ Có thể đặt cả 2 ống vào 370C trong 5 – 10 phút, quan sát hiện tượng.

– Kết quả:?

– Giải thích: ?

1.2.Tính đặc hiệu của α–amylase nước bọt và saccarozơ nấm men:

– Chuẩn bị:

+ Dung dịch α–amylase nước bọt, sucrase nấm men, tinh bột 1%,

saccarozơ 1%, thuốc thử Lugol, thuốc thử Fehling

+ Ống nghiệm,pipet, đèn cồn

– Tiến hành:

+ Lấy 4 ống nghiệm, cho vào ống A và B: 2ml dung dịch tinh

bột/ống; ống C và D: 2ml dung dịch saccarozơ/ống.

+ Thêm vào ống A và C: 0,5ml dung dịch nước bọt; ống B và D:

0,5ml dung dịch sucrase nấm men.

+ Lắc đều các ống, giữ ở 37–400C trong 10 phút.

+ Làm lạnh ống A và B, thêm vài giọt thuốc thử Lugol và quan sát

hiện tượng.

+ Thêm thuốc thử Fehling vào ống C và D, đun nóng và quan sát hiện

tượng.

54



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Rèn các kỹ năng thực hành:

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×