Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tải bản đầy đủ - 0trang

Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

16



- Chuẩn bị dịch chiết cồn : Cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 mL, thêm

50 mL EtOH 900, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng.

- Chuẩn bị dịch chiết ether dầu hỏa : Cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 50

mL, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm, lọc. Dịch lọc dùng để làm các phản ứng.

3.1.1 Định tính alcaloid

Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 mL, thêm dung dịch H2SO4

2% cho ngập dược liệu, đun sôi vài phút. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn,

kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH kiềm. Chiết alcaloid bằng

cloroform (CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5 mL. Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc

với H2SO4 2%. Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1

mL rồi thêm vào :

- Ống 1 : 2-3 giọt TT Dragendorff, dung dịch trong suốt, khơng có tủa vàng cam.

- Ống 2 : 2-3 giọt TT Mayer, dung dịch trong suốt, không có tủa vàng nhạt.

- Ống 3 : 2-3 giọt TT Bouchardat, dung dịch trong suốt, khơng có tủa nâu.

Kết luận : dược liệu khơng có alcaloid.

3.1.2 Định tính anthranoid

- Phản ứng Borntraeger: cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 mL, thêm 10

mL dung dịch H2SO4 25% cho ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút. Lọc dịch

chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 mL ether. Lấy 1 mL dịch ether cho vào

ống nghiệm, thêm 1mL KOH 10%, lắc kỹ, quan sát thấy lớp KOH khơng có màu.

Kết luận : dược liệu khơng có anthranoid.

3.1.3 Định tính flavonoid

- Phản ứng Cyanidin : cho 2 mL dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít

bột Mg kim loại, rồi thêm vài giọt HCl đặc. Đun nóng trên bếp cách thủy sau vài

phút thấy xuất hiện màu tím đỏ.



17



- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% : cho 2 mL dịch chiết cồn vào một ống nghiệm,

thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy dung dịch chuyển màu xanh sẫm.

- Phản ứng với kiềm : Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc, hơ khô rồi

đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc thấy màu vàng hiện rõ, khi soi dưới đèn tử

ngoại thấy có màu vàng sáng.

Kết luận : dược liệu có chứa flavonoid.

3.1.4 Định tính saponin

- Hiện tượng tạo bọt : Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5 mL

HCl 0,1 N và ống thứ 2 là 5 mL NaOH 0,1 N. Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dịch

chiết cồn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây. Để yên, thấy cột bọt

ở 2 ống bền vững và bằng nhau.

- Phản ứng Salkowski : Lấy 10 mL dịch chiết cồn cho vào bình nón và thêm 10 mL

H2SO4 lỗng. Đun sôi cách thủy vài phút. Để nguội, chiết với cloroform. Lấy

khoảng 2 mL dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm. Thêm từ từ 1 mL H2SO4

đặc theo thành ống nghiệm, quan sát thấy giữa hai lớp xuất hiện vòng màu xanh lá.

- Phản ứng Liebermann - Burchardt : Lấy 1 mL dịch chiết cloroform ở trên cho vào

1 ống nghiệm rồi cô tới cắn. Cho vào cắn 0,5 mL anhydrid acetic, lắc đều, đặt

nghiêng ống 450 rồi thêm 0,5 mL acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch

lỏng trong ống chia thành 2 lớp, quan sát thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng

trong ống nghiệm có màu đỏ.

Kết luận : dược liệu có chứa saponin, sơ bộ là nhóm triterpenoid.

3.1.5 Định tính tanin

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1% : lấy 1g dược liệu cho vào bình nón dung tích

50 mL. Thêm nước ngập dược liệu rồi đun sơi vài phút. Lọc nóng, lấy 1 mL dịch

lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, không quan sát thấy

tủa bông.

Kết luận : dược liệu khơng có tanin.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

18



19



3.1.6 Định tính coumarin

- Phản ứng mở và đóng vòng lacton :

+ Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 mL dịch chiết cồn, ống 1 thêm 0,5 mL dung

dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên.

+ Đun cả 2 ống nghiệm cách thủy đến sôi, để nguội. Quan sát thấy ống 1 có màu tủa

đục màu vàng, ống 2 trong suốt.

+ Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 mL nước cất, lắc đều. Quan sát thấy ống 1

trong hơn, ống 2 có tủa đục, acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 đục.

- Phản ứng với thuốc thử diazo : cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết cồn, thêm

vào đó 2 mL dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt

thuốc thử diazo (mới pha), thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch.

Kết luận : dược liệu có coumarin.

3.1.7 Định tính acid amin

- Phản ứng với ninhydrin : lấy 3 mL dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm. Thêm vài

giọt thuốc thử Ninhydrin 0,5%, đun sôi 2 phút, không quan sát thấy dung dịch

chuyển màu tím.

Kết luận : dược liệu khơng có acid amin.

3.1.8 Định tính acid hữu cơ

- Phản ứng với Na2CO3 : cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết cồn và cơ tới cắn.

Hòa cắn trong 1 mL nước và thêm vài tinh thể Na2CO3 thấy có bọt khí nổi lên.

Kết luận : dược liệu có acid hữu cơ.

3.1.9 Định tính đường khử

- Phản ứng với TT Fehling : lấy 1 mL dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm, thêm 3

giọt TT Fehling A và 3 giọt TT Fehling B, đun cách thủy trong 10 phút, không quan

sát thấy tủa màu đỏ.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

20



Kết luận : dược liệu khơng có đường khử.

3.1.10 Định tính chất béo

Nhỏ vài giọt dịch chiết ether dầu hỏa trên giấy lọc, hơ khô, không quan sát

thấy vết mờ trên giấy.

Kết luận : dược liệu khơng có chất béo.

3.1.11 Định tính carotenoid

- Phản ứng với H2SO4 đặc : cô 5 mL dịch chiết ether dầu hỏa tới cắn, thêm 1-2 giọt

acid sulfuric đặc, không thấy xuất hiện màu xanh ve.

Kết luận : dược liệu khơng có carotenoid.

3.1.12 Định tính phytosterol

- Phản ứng Liberman : Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết ether dầu hỏa. Bốc hơi

dung môi đến khô, cho vào ống nghiệm 1 mL anhydrid acetic, lắc kỹ, thêm 1 mL

H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Kết quả cho thấy giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện

một vòng tím đỏ.

Kết luận : dược liệu có phytosterol.

3.1.13 Định tính tinh dầu

Nhỏ vài giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, thấy có mùi thơm.

Kết luận : dược liệu có tinh dầu.

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong Hương nhu tía bằng phản ứng

hóa học được tóm tắt trong bảng 3.1.



21



Bảng 3.1 : Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, lá Hương nhu

tía (Ocimum sanctum L.) bằng phản ứng hóa học.

STT



1



2



3



4



Nhóm chất



Alcaloid



Anthranoid



Flavonoid



Saponin



Phản ứng



Kêt quả



Phản ứng với TT Dragendorff



-



Phản ứng với TT Mayer



-



Phản ứng với TT Bouchardat



-



Phản ứng Borntraeger



-



Phản ứng Cyanidin



+



Phản ứng với dd FeCl3 5%



+



Phản ứng với kiềm



+



Phản ứng tạo bọt



++



Phản ứng Salkowski



++



Phản ứng Liebermann - Burchardt



++



Kết luận



Khơng



Khơng







Saponin

triterpenoid



Phản ứng với dd gelatin 1%



-



Phản ứng mở và đóng vòng lacton



+



Phản ứng với thuốc thử diazo



+



Phản ứng với TT Ninhydrin 0,5%



-



Không



Acid hữu cơ



Phản ứng với Na2CO3



+







9



Đường khử



Phản ứng với TT Fehling



-



Khơng



10



Chất béo



Vết mờ trên giấy lọc



-



Khơng



11



Carotenoid



Phản ứng với H2SO4 đặc



-



Khơng



12



Phytosterol



Phản ứng Liberman



+







13



Tinh dầu



Có mùi thơm



++







5



Tanin



6



Coumarin



7



Acid amin



8



Khơng





Ghi chú : (-) âm tính, (+) dương tính, (++) dương tính rõ.

Nhận xét : Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy cành, lá Hương

nhu tía có chứa saponin triterpenoid, flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, phytosterol,



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

22



tinh dầu và bằng phương pháp này khơng thấy sự có mặt của alcaloid, tanin,

anthranoid, acid amin, đường khử, chất béo và carotenoid.

Như vậy, theo kết quả định tính ở trên, trong thành phần hóa học của Hương

nhu tía có nhóm saponin triterpenoid. Tiếp theo chúng tơi sẽ tiến hành định tính

acid ursolic trong Hương nhu tía bằng SKLM.



3.2 Định tính acid ursolic trong cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum

L.) bằng SKLM

Tiến hành chạy sắc ký cắn MeOH so sánh với acid ursolic đối chứng trên 2 hệ

dung môi.

Sắc ký đồ của 2 hệ dung mơi ở hình 3.1.



Hình 3.1 : Sắc ký đồ của cắn MeOH toàn phần với acid ursolic đối chứng trên

các hệ dung môi khai triển.

(a) Hệ 1 : CHCl3 : MeOH = 9 : 1 (tt/tt).

(b) Hệ 2 : ether dầu hỏa : EtOAc = 4 : 6 (tt/tt).

Phương pháp phát hiện : soi UV ở bước sóng 254 nm, 365 nm và thuốc thử H2SO4

10%/EtOH, hơ nóng trên bếp điện.

(1) acid ursolic đối chứng ; (2) cắn MeOH toàn phần ; (1+2) chấm chồng acid

ursolic và cắn MeOH toàn phần.



23



Nhận xét : Sắc ký đồ cho thấy acid ursolic khơng hấp thụ UV ở 2 bước sóng

254 nm và 365 nm, hiện màu tím đỏ với thuốc thử H2SO4 10%/EtOH khi hơ nóng

trên bếp điện. Trên 2 hệ dung môi khai triển khác nhau, SKLM cho thấy trong dịch

chiết MeOH tồn phần có vết có màu sắc (tím đỏ) và có Rf tương đương với acid

ursolic đối chứng khi dùng thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH, do đó có thể sơ bộ

xác định trong mẫu Hương nhu tía nghiên cứu có acid ursolic.



3.3 Phân lập acid ursolic từ cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)

bằng sắc ký cột

Chiết hồi lưu 1 kg dược liệu đã xay nhỏ (độ ẩm 15,63%) với dung môi MeOH

ở nhiệt độ 600C trên bếp cách thủy, chiết 3 lần, mỗi lần với 5 L dung môi trong 2

giờ. Gộp các dịch chiết, lọc qua giấy lọc thu lấy phần dịch, cất thu hồi dung môi

dưới áp suất giảm tới khi hết dung môi, thu được 42,45 g cắn MeOH toàn phần.

Phân tán cắn MeOH tồn phần trong một lượng tối thiểu nước nóng, sau đó

chiết lần lượt với các dung mơi : n-hexan, DCM, EtOAc (chiết mỗi phân đoạn 3

lần), thu được dịch chiết các phân đoạn, rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

các dịch chiết đó tới cắn. Cân khối lượng các cắn.

Quá trình chiết các phân đoạn từ dược liệu được tóm tắt ở hình 3.2.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

24



Cành, lá Hương nhu

tía xay nhỏ (1kg)

Chiết hồi lưu với MeOH

5L x 3 lần, mỗi lần 2h

Dịch chiết MeOH

(*)

Cắn MeOH

(42,45 g)

Nước nóng

Dịch chiết nước

Dịch chiết

n-hexan



n-hexan



(*)



Cắn n-hexan

(10,12 g)



Dịch chiết nước

Dịch chiết

DCM



DCM

Dịch chiết nước



Dịch chiết

EtOAc



EtOAc



(*)



(*)



Cắn DCM

(11,34 g)



Cắn EtOAc

(3,75 g)



Dịch chiết nước

Hình 3.2 : Tóm tắt quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cành, lá Hương nhu

tía (Ocimum sanctum L.)

(*) : cất thu hồi dung môi



25



Tiến hành chấm các cắn phân đoạn trên SKLM với acid ursolic đối chứng để

xác định phân đoạn tách chất.

- Chuẩn bị mẫu thử và mẫu đối chứng :

+ Mẫu đối chứng : 1 mg acid ursolic hòa tan trong 1 mL MeOH.

+ Các mẫu thử được chuẩn bị như sau : 5 mg cắn hòa tan vào 1 mL dung mơi

tương ứng.

- Hệ dung môi khai triển : CHCl3 : MeOH = 95 : 5 (tt/tt).

- Phương pháp hiện màu : phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng trên

bếp điện.



Hình 3.3 : Sắc ký đồ các cắn phân đoạn với acid ursolic đối chứng.

(C) acid ursolic đối chứng ; (H) cắn n-hexan ; (D) cắn DCM ; (E) cắn EtOAc.

Thuốc thử hiện màu là H2SO4 10% trong EtOH.

Nhận xét : Dựa trên hình ảnh sắc ký đồ ở hình 3.3, ta thấy chất có Rf tương

đương với acid ursolic nằm chủ yếu ở phân đoạn DCM (vết đậm màu nhất), do đó

chúng tơi sẽ tiến hành tách chất đó từ phân đoạn DCM.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

26



Tiến hành phân lập chất từ phân đoạn DCM bằng sắc ký cột :

- Chuẩn bị chất hấp phụ

Đong 300 mL Silicagel 60 (cỡ hạt 0,04 - 0,063 mm) được hoạt hóa ở 110 0C

trong 1h. Để nguội ở bình hút ẩm.

- Chuẩn bị cột

Chọn cột sắc ký kích thước 5x25 cm, lắp thẳng đứng trên giá. Vặn khóa cột.

Lót 1 lớp bơng sạch ở đáy cột. Thêm DCM vào silicagel đã hoạt hóa, khuấy đều tạo

hỗn dịch, chú ý loại bỏ hết bọt khí. Rót từ từ hỗn dịch lên cột theo thành cột. Dùng

pipet rửa thành cột bằng DCM. Cho dung môi chạy qua cột vài lần để ổn định cột.

- Chuẩn bị mẫu đưa lên cột

Hòa tan hồn tồn cắn (11,34 g) vào lượng tối thiểu dung môi DCM, rồi cho

20 mL silicagel vào khuấy đều cho chất hấp phụ hết lên silicagel. Tiếp tục khuấy

cho dung môi bay hơi tự nhiên đến khi khơ tơi.

- Đưa chất lên cột

+ Mở khóa cột cho dung môi chảy từ từ đến khi lớp dung môi trong cột gần bề

mặt silicagel.

+ Đưa từ từ silicagel đã hấp phụ chất lên cột, tránh xáo trộn cột. Chú ý phải

đưa từ từ để tránh silicagel vón cục và phân tán không đều.

+ Bổ sung nhẹ nhàng dung môi DCM, tránh gây xáo trộn.

- Rửa giải

+ Sử dụng hệ dung môi DCM và MeOH tăng dần độ phân cực (gradient lượng

MeOH từ 0% đến 10%).

+ Điều chỉnh khóa cột sao cho tốc độ rửa giải khoảng 20 giọt/phút.

+ Dịch rửa giải được hứng vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự, mỗi ống

hứng khoảng 20 mL.

+ Kiểm tra dịch rửa giải ở các ống nghiệm bằng SKLM, chấm đối chứng với

acid ursolic chuẩn, hệ dung môi khai triển là CHCl3 : MeOH = 95 : 5 (tt/tt), thuốc

thử hiện màu là H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng trên bếp điện.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×