Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

17







Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research.







Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent.







Cân phân tích, tủ sấy, cân kỹ thuật, máy lọc nước cất, bếp điện và các thiết bị bào



chế, kiểm nghiệm khác.

2.2.



NỘI DUNG NGHIÊN CỨU







Bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn chứa vitamin E.







Đánh giá ảnh hưởng của yếu tố tá dược và thời gian siêu âm đến kích thước tiểu



phân và khả năng giải phóng dược chất từ hệ tiểu phân nano. Đánh giá một số tính

chất của hệ tiểu phân nano.





Bào chế gel chứa hệ tiểu phân nano lipid rắn vitamin E.







Đánh giá một số tính chất của gel chứa hệ tiểu phân nano lipid rắn vitamin E.



2.3.



PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU



2.3.1. Phương pháp bào chế

2.3.1.1. Bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn chứa vitamin E

Lipid rắn + CDH thân dầu



Vitamin E



Đun chảy



Hòa tan

Nước cất vđ



Siêu âm

tần số 30000 Hz

biên độ 100 µm



70 – 80oC

Phối hợp ở 70 – 80oC



Khuấy từ

tốc độ 700 vòng/phút



Hòa tan

CDH thân nước



20 phút

Để nguội



Hệ tiểu phân nano lipid rắn

Hình 2.1. Sơ đồ bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn chứa vitamin E



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

18



Bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn chứa vitamin E bằng phương pháp siêu

âm kết hợp khuấy từ. Quá trình được tiến hành như sau:





Lipid rắn và chất diện hoạt thân dầu được đun chảy ở 70 – 80C trong bát sứ, sau



đó hòa tan vitamin E đến khi thu được dung dịch trong suốt. Duy trì nhiệt độ.





Hòa tan CDH thân nước vào nước vừa đủ, duy trì nhiệt độ 70 – 80oC và đem



khuấy từ ở tốc độ 700 vòng/phút kèm siêu âm ở tần số 30000 Hz, biên độ 100 µm.





Đổ từ từ pha lipid vào pha nước và tiếp tục siêu âm, khuấy từ trong 20 phút.







Để nguội mẫu ở nhiệt độ phòng.

Q trình bào chế ln sử dụng biện pháp tránh ánh sáng cho các thành phần



chứa vitamin E. Mẫu sau khi bào chế được đựng trong lọ thủy tinh, bọc giấy nhơm

bên ngồi.

2.3.1.2. Bào chế gel từ SLNs chứa vitamin E

Qua tham khảo tài liệu [2] và quá trình khảo sát sơ bộ, gel chứa hệ tiểu phân

nano lipid rắn vitamin E được xây dựng công thức như sau:

Hệ tiểu phân nano lipid rắn vitamin E

Carbopol 940

Triethanolamin

Glycerin

Nước cất vừa đủ

Quy trình bào chế gel được tóm tắt trong hình 2.2, cụ thể:





Ngâm Carpobol 940 trương nở hoàn toàn trong nước, thêm triethanolamin, dùng



đũa thủy tinh khuấy nhẹ nhàng, một chiều được hỗn hợp 1.





Hòa tan glycerin vào hệ tiểu phân nano lipid rắn vitamin E trong cốc có mỏ thu



được hỗn hợp 2.





Phân tán từ từ từng ít một hỗn hợp 2 vào hỗn hợp 1, khuấy nhẹ nhàng, một chiều.







Bổ sung nước vừa đủ, từng ít một, khuấy nhẹ nhàng, một chiều đến khi thu được



gel mịn và đồng nhất.





Gel được bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòng.



19



Carbopol 940



Ngâm trương nở



Triethanolamin



Khuấy nhẹ nhàng



Phối hợp từng ít một, khuấy

nhẹ nhàng, một chiều



Hòa tan

glycerin trong

SLNs vitamin E



Bổ sung nước cất vừa đủ, từng ít một,

khuấy nhẹ nhàng, một chiều



Gel chứa SLNs vitamin E

Hình 2.2. Sơ đồ bào chế gel chứa hệ tiểu phân nano lipid rắn vitamin E

2.3.2. Phương pháp đánh giá hệ tiểu phân nano lipid rắn chứa vitamin E

2.3.2.1. Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ vitamin E và

độ hấp thụ UV-VIS

Cân chính xác khoảng 0,1250 g vitamin E (alpha tocopherol acetat), hòa tan

trong ethanol vừa đủ 50 ml được dung dịch A. Lấy 1 ml dung dịch A, pha loãng với

ethanol vừa đủ 25 ml, thu được dung dịch có nờng độ chính xác khoảng 100 μg/ml.

Qt phổ dung dịch vừa pha bằng máy đo quang phổ UV-VIS HITACHI U1800 trong

dải bước sóng từ 200 – 400 nm. Xác định bước sóng tại đỉnh hấp thụ cực đại.

Lấy 5 ml dung dịch A pha loãng bằng ethanol vừa đủ 25 ml. Từ dung dịch này

đem pha loãng tiếp với ethanol để được các dung dịch có nờng độ 25; 50; 75; 100;

125; 150; 175 và 200 μg/ml. Đo độ hấp thụ UV-VIS của dãy 8 dung dịch này tại bước

sóng cực đại xác định ở trên. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ

vitamin E trong dung môi ethanol theo mật độ quang.

2.3.2.2. Đánh giá sự giải phóng vitamin E từ hệ tiểu phân nano

a. Điều kiện thử giải phóng



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

20



Qua tham khảo tài liệu [2], [31] và xét đến điều kiện cơ sở vật chất hiện có,

hàm lượng vitamin E giải phóng từ hệ tiểu phân nano được đánh giá bằng hệ thống

giải phóng qua màng Hanson Research với các điều kiện cụ thể như sau:





Màng giải phóng: màng cellulose acetat 0,2 μm (ngâm bão hòa mơi trường giải



phóng trong 20 phút trước khi thử); diện tích thử 1,767 cm2.





Mơi trường giải phóng: ethanol tuyệt đối.







Thể tích mơi trường giải phóng: 7 ml.







Nhiệt độ thử: 37C.







Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút.







Thể tích mẫu thử: 1 ml.







Ngăn cho là vòng chứa mẫu có đường kính trong bằng đường kính trong của ngăn



nhận và chiều cao vừa đủ để ngăn chứa được 1 ml hệ tiểu phân nano.

b. Chuẩn bị mẫu chuẩn, cách thức tiến hành và xác định hàm lượng vitamin E

giải phóng

 Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0,1250 g vitamin E. Hòa tan trong ethanol vừa

đủ 100 ml. Lấy 1 ml dung dịch này pha lỗng bằng ethanol trong bình định mức 25

ml được dung dịch vitamin E chuẩn có nồng độ 50 μg/ml.

 Tiến hành thử.

Tại thời điểm t = 0 phút, bơm chế phẩm thử vào ngăn cho. Tiến hành lấy mẫu

là mơi trường giải phóng tại các thời điểm t = 30, 60, 120, 180 phút. Thể tích mỗi lần

lấy là 1 ml. Q trình lấy mẫu đờng thời cũng là q trình thêm mơi trường giải phóng

vào ngăn nhận với thể tích bằng thể tích mơi trường đã lấy ra. Mẫu môi trường lấy ra

đem pha lỗng 5 lần bằng dung mơi thử giải phóng. Xác định lượng vitamin E giải

phóng bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 286 nm rời đem so sánh

với mẫu chuẩn.

 Xác định hàm lượng vitamin E giải phóng từ hệ tiểu phân nano.

Sau thời gian t1 = 30 phút, tỷ lệ vitamin E giải phóng từ hệ tiểu phân tính theo

cơng thức:



21



A1

100

X1 (%) = ( × Cc × 10−6 × 5 × 7) ×

× 100(%)

Ac

𝑚1 × m

Sau thời gian tk phút (k = 2, 3, 4), tỷ lệ vitamin E giải phóng từ hệ tiểu phân

được tính theo cơng thức:

k−1



X k (%) = (Ak × 7 + ∑ Ai ) ×

i=1



Cc

100

× 10−6 × 5 ×

× 100(%)

Ac

𝑚1 × m



Trong đó:

+



Ac, Ak tương ứng là mật độ quang của dung dịch chuẩn và dung dịch mơi trường



giải phóng lấy tại thời điểm tk phút (k = 2, 3, 4).

+



5 là hệ số pha lỗng của mẫu mơi trường giải phóng lấy được.



+



7 là thể tích mơi trường giải phóng có trong ngăn nhận (ml).



+



m1 là khối lượng của 1 ml mẫu SLNs đem thử (g).



+



m là khối lượng vitamin E trong 100 g mẫu tính theo lý thuyết (g).



2.3.2.3. Định lượng nồng độ vitamin E trong hệ tiểu phân nano

Ở đây, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng để định lượng

vitamin E trong hệ tiểu phân nano lipid rắn.

a. Điều kiện sắc ký

Qua tham khảo tài liệu [18] kết hợp với quá trình khảo sát tách vitamin E bằng

phương pháp HPLC, điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau:





Pha động: là hỗn hợp methanol : nước cất (98 : 2), được siêu âm trong 15 phút.







Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.







Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.







Detector UV phát hiện ở bước sóng 284 nm.







Nhiệt độ: nhiệt độ phòng.



b. Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ vitamin E

Cân chính xác khoảng 0,0250 g vitamin E (alpha tocopherol acetat), hòa tan

trong methanol vừa đủ 50 ml thu được dung dịch có nờng độ 500 μg/ml, lọc qua màng

0,45 μm. Từ dung dịch này pha loãng bằng methanol thành các dung dịch có nờng độ

50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 μg/ml, chạy HPLC với điều kiện được trình



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

22



bày trong mục 2.3.2.3 a. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ

vitamin E với diện tích pic.

c. Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử, xác định hàm lượng vitamin E





Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0,0500 g vitamin E, hòa tan trong methanol



vừa đủ 25 ml. Lấy 1 ml dung dịch này pha lỗng 10 lần bằng methanol được dung

dịch có nờng độ 200 µg/ml. Lọc qua màng 0,45 µm.





Mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,5000 g mẫu SLNs vitamin E, hòa tan hồn tồn



trong khoảng 20 ml ethanol, rời bổ sung ethanol vừa đủ 25 ml. Lọc qua màng 0,45

µm.





Xác định hàm lượng vitamin E bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Hàm lượng vitamin E (%) có trong hệ tiểu phân nano so với hàm lượng lý



thuyết tính theo cơng thức sau:

𝐻 (%) =



𝑆𝑡

100

× 𝐶𝑐 × 10−6 × 25 ×

× 100 (%)

𝑆𝑐

𝑚1 × 𝑚



Trong đó:

+



Sc, St tương ứng là diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử (mAU.s).



+



Cc là nồng độ dung dịch vitamin E chuẩn (µg/ml).



+



25 là hệ số pha lỗng của dung dịch thử.



+



m1 là khối lượng mẫu SLNs vitamin E đem định lượng (g).



+



m là khối lượng vitamin E có trong 100 g SLNs tính theo lý thuyết (g).



2.3.2.4. Đánh giá hình thái và kích thước hệ tiểu phân nano bằng kính hiển vi

điện tử truyền qua (TEM)

Hình thái và kích thước của các tiểu phân trong hệ nano lipid rắn được quan

sát qua kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1010 có độ phóng đại M = x50 –

x600.000, độ phân giải  = 3A, điện áp gia tốc U = 40 – 100 kV.

Phương pháp tiến hành dựa trên nguyên tắc: dùng các chùm điện tử đi qua

mẫu vật để tạo ảnh mẫu nghiên cứu, hiện ảnh lên màn hình huỳnh quang với độ phóng

đại theo yêu cầu.



23



2.3.2.5. Đánh giá kích thước và phân bố kích thước bằng máy Zetasizer Nano

ZS90

Kích thước hạt được xác định bằng phương pháp tán xạ lase. Nguyên lý của

phương pháp là khi chiếu chùm tia lase vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu

được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Bằng cách đo cường độ ánh sáng tán xạ có

thể xác định được kích thước tiểu phân.

Sử dụng máy phân tích kích thước hạt Zetasizer Nano ZS90 đo kích thước hạt

trong khoảng 0,01 – 10000 nm. Mẫu được pha loãng bằng nước cất 200 lần trước khi

đem đo, nhiệt độ đo 25oC. Phân bố kích thước tiểu phân cũng được dùng để đánh giá

hệ SLNs thông qua chỉ số đa phân tán (PDI), PDI càng gần bằng 0 thì chứng tỏ các

tiểu phân trong hệ có kích thước càng đờng đều.

2.3.3. Phương pháp đánh giá gel chứa hệ tiểu phân nano vitamin E

2.3.3.1. Đánh giá sự giải phóng vitamin E từ gel

a. Điều kiện thử giải phóng

Qua q trình khảo sát, tỷ lệ vitamin E giải phóng từ gel được xác định bằng

hệ thống đánh giá giải phóng qua màng Hanson Research với các điều kiện như sau:





Màng giải phóng: màng cellulose acetat 0,2 µm (ngâm bão hòa mơi trường giải



phóng 20 phút trước khi thử); diện tích thử 1,767 cm2.





Khối lượng gel thử: chính xác khoảng 1,0000 g.







Thành phần mơi trường, thể tích mơi trường giải phóng cũng như nhiệt độ và tốc



độ khuấy như trong mục 2.3.2.2 a.

b. Chuẩn bị mẫu chuẩn, cách thức tiến hành và xác định tỷ lệ vitamin E giải

phóng từ gel





Mẫu chuẩn: được chuẩn bị như mục 2.3.2.2 b.







Cách thức tiến hành.

Tại thời điểm t = 0, cho gel vào ngăn cho. Lấy mẫu là mơi trường giải phóng



tại các thời điểm t = 0,5; 1; 2; 3; 4 và 5 giờ. Thể tích mỗi lần lấy là 1 ml. Q trình

lấy mẫu đờng thời cũng là q trình thêm mơi trường giải phóng vào ngăn nhận với

thể tích bằng thể tích mơi trường đã lấy ra. Mẫu môi trường lấy ra được đem pha



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

24



loãng 5 lần bằng dung mơi thử giải phóng. Xác định lượng vitamin E giải phóng bằng

phương pháp đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 286 nm rời đem so sánh với mẫu

chuẩn.





Xác định phần trăm vitamin E giải phóng từ gel.

Sau t1 = 0,5 giờ, phần trăm vitamin E giải phóng từ gel tính theo cơng thức:

X1 (%) = (



A1

100

× Cc × 10−6 × 5 × 7) ×

× 100(%)

Ac

𝑚2 × m



Sau tk giờ (k = 2, 3, 4, 5, 6) phần trăm vitamin E giải phóng từ gel tính theo:

k−1



X k (%) = (Ak × 7 + ∑ Ai ) ×

i=1



Cc

100

× 10−6 × 5 ×

× 100(%)

Ac

𝑚2 × m



Trong đó:

+



Ac , Ak tương ứng là mật độ quang của dung dịch chuẩn và dung dịch môi trường



thử tại thời điểm tk (k = 2, 3, 4, 5, 6).

+



Cc là nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml).



+



5 là hệ số pha lỗng của mẫu mơi trường lấy được.



+



7 là thể tích mơi trường có trong ngăn nhận (ml).



+



m2 là khối lượng gel thử (g).



+



m là khối lượng vitamin E trong 100 g gel tính theo lý thuyết (g).



2.3.3.2. Định lượng nồng độ vitamin E trong gel

Định lượng vitamin E trong gel bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

a. Điều kiện sắc ký: như mục 2.3.2.3 a.

b. Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử, xác định hàm lượng vitamin E .





Mẫu chuẩn được chuẩn bị như mục 2.3.2.3 b.







Mẫu thử: cân chính xác khoảng 1,0000 g gel chứa SLNs vitamin E. Phân tán



trong khoảng 40 ml ethanol, đem siêu âm 15 phút để hòa tan hết các thành phần, rồi

bổ sung ethanol vừa đủ 50 ml. Lọc qua màng 0,45 µm.





Xác định hàm lượng vitamin E bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Hàm lượng vitamin E (% ) có trong gel chứa hệ tiểu phân nano so với hàm



lượng lý thuyết tính theo cơng thức sau:



25



𝐻 (%) =



𝑆𝑡

100

× 𝐶𝑐 × 10−6 × 50 ×

× 100%

𝑆𝑐

𝑚2 × 𝑚



Trong đó:

+



Sc, St tương ứng là diện tích pic vitamin E của dung dịch chuẩn và dung dịch thử

(mAU.s).



+



Cc là nồng độ dung dịch vitamin E chuẩn (µg/ml).



+



50 là hệ số pha lỗng của mẫu thử.



+



m2 là khối lượng gel đem định lượng (g).



+



m là khối lượng vitamin E trong 100 g gel tính theo lý thuyết (g).



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

26



Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ NHẬN XÉT

3.1. Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ vitamin E và mật độ quang

Đo quang dãy dung dịch vitamin E chuẩn: 25; 50; 75; 100; 125; 150; 175 và

200 μg/ml được chuẩn bị như ở mục 2.3.2.1 tại bước sóng 286 nm. Kết quả được ghi

trong bảng 3.1. và hình 3.1.

Bảng 3.1. Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn vitamin E ở bước sóng 286 nm

Nồng độ (µg/ml) 25,22 50,44 75,66 100,88 126,1 151,32 176,54 201,76

Mật độ quang

0,099 0,159 0,213 0,276 0,331 0,379 0,435 0,487

( = 286 nm)

0,6



y = 0,0022x + 0,0483

R² = 0,9991



Mật độ quang



0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

0



25



50

75

100 125 150 175 200

Nồng độ dung dịch chuẩn vitamin E (µg/ml)



225



Hình 3.1. Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ vitamin E

và mật độ quang

Nhận xét:

Kết quả cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa mật độ quang với nồng độ vitamin

E trong khoảng nờng độ từ 25,22 đến 201,76 µg/ml với hệ số tương quan R 2  1. Do

đó có thể sử dụng phương pháp so sánh để tính nờng độ vitamin E trong mẫu thử khi

mật độ quang của mẫu thử nằm trong khoảng 0,099 – 0,487 tại bước sóng 286 nm.

3.2. Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ vitamin E và diện tích pic

Pha dãy dung dịch vitamin E chuẩn có nờng độ 50, 100, 150, 200, 250, 300,

400, 500 μg/ml như mục 2.3.2.3 b rồi tiến hành chạy HPLC theo điều kiện như ở mục

2.3.2.3 a. Kết quả được ghi trong bảng 3.2. và hình 3.2.



27



Bảng 3.2. Diện tích pic của dãy dung dịch chuẩn vitamin E



Diện tích pic (mAU.s)



Nồng độ

53,6 107,2 160,8 214,4 268

335

402

469

536

(µg/ml)

Diện tích pic

147,2 268,4 398,8 550,2 684,8 869,1 1038,1 1199,2 1407,6

(mAU.s)

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

0



y = 2,6086x - 8,6787

R² = 0,9993



0



50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600

Nồng độ dung dịch chuẩn (μg/ml)



Hình 3.2. Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ vitamin E

và diện tích pic

Nhận xét:

Kết quả cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic với nồng độ

vitamin E trong khoảng nồng độ từ 53,6 đến 536 µg/ml với hệ số tương quan R 2 1.

Do đó có thể sử dụng phương pháp so sánh để xác định nồng độ vitamin E trong mẫu

thử khi diện tích pic vitamin E của mẫu thử nằm trong khoảng 147,2 – 1407,6 mAU.s

với điều kiện sắc ký như ở mục 2.3.2.3 a.

3.3. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố tá dược đến kích thước tiểu phân và tỷ lệ

vitamin E giải phóng từ hệ tiểu phân nano lipid rắn

3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của chất mang lipid

Qua tham khảo tài liệu [2], [12], [31] và khảo sát thực tế, công thức SLNs

vitamin E được xây dựng với tỷ lệ vitamin E là 1% (kl/kl) và tỷ lệ chất mang lipid là

5% (kl/kl).



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×