Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
2 Phương pháp định tính enzyme cellulase trên đĩa thạch.

2 Phương pháp định tính enzyme cellulase trên đĩa thạch.

Tải bản đầy đủ - 0trang

Ủ các đĩa khảo sát ở 37 oC 12 giờ và quan sát vòng phân giải trên đĩa (Nguyễn

Văn Phúc, 2014).

Nêú vòng phân giải trên đĩa thạch bị mờ có thể cho thuốc thử lugol vào đĩa để

dễ quan sát vòng phân giải.



Hình: Vòng phân gải CMC của enzyme cellulase trên dĩa thạch với thuốc thử

logol

3.3 Định tính cellulase bằng phương pháp nhuộm Congo đỏ (Jonh N., 1985)

-



Chuẩn bị:

Đệm phosphat 0.5 M pH 7,0

Dung dịch Congo đỏ 1%

NaCl 1M



-



Tiến hành:



+



Vi khuẩn sau khi phân lập được pha lỗng và ni cấy trên môi trường chọn

lọc ở điều kiện 37oC trong 20h để tạo dịch enzyme.

11



+



Hút 70µl dịch enzyme nhỏ lên đĩa thạch đã đục lỗ trên mơi trường thử hoạt



+



tính, ủ ở điều kiện 30oC trong vòng 24h rồi đem ra nhuộm Congo đỏ.

Tiến hành nhuộm Congo đỏ: Đổ Congo đỏ 1% ngập đĩa thạch trong 15 phút,

rồi chắt bỏ và tiếp tục nhuộm với NaCl 1M trong 15 phút. Vùng phân giải

cellulose xuất hiện dưới dạng một vùng sáng trong trên nền đỏ của Congo.

Hoạt tính tương đối của enzyme tỷ lệ thuận với kích thước đường kính vòng



phân giải cơ chất.

Đường kính vòng phân giải = D - d

Trong đó:

D: là đường kính vòng ngồi.

d: là đường kính lỗ.

4 LIPASE.

4.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase (Sharma C.K. và cộng



sự, 2012).

Phương pháp xác định là phương pháp đo màu (Colorimetric Method). Bước

sóng hấp phụ của ƿ – nitrophenol được giải phóng sau khi bị phân giải là 410 nm.

Hoạt tính enzyme được xác định bằng µmol ƿ – nitrophenol được tạo ra trên phút

bởi một thể tích (ml) enzyme tự do hoặc một khối lượng (g) enzyme cố định (bao

gồm cả chất nền) dước điều kiện xác định tiêu chuẩn. Đơn vị hoạt tính riêng được

thể hiện bằng µmol ƿ – nitrophenol được tạo ra trong một phút trên mg protein.

Phương pháp được sử dụng trên nhiều loại cơ chất khác nhau như:

ƿ – nitrophenyl formate (ƿ – NPF)

ƿ – nitrophenyl acetat (ƿ – NPA)

ƿ – nitrophenyl benzoate (ƿ – NPB)

ƿ – nitrophenyl caprylate (ƿ – NPC)

ƿ – nitrophenyl laurate (ƿ – NPL)

ƿ – nitrophenyl palmitate (ƿ – NPP)

Hoạt tính của enzyme lipase được xác định bằng cách sử dụng một trong

những cơ chất trên, trong đó có thể sử dụng ƿ – nitrophenyl palmitate (ƿ – NPP),

12



một cơ chất mang màu. Hoạt tính của lipase tinh khiết hay lipase thơ hoặc lipase có

gắn với chất mang đều được xác định bằng phương pháp đo màu.

Một dung dịch stock (20 mM) ƿ – nitrophenyl palmitate được chuẩn bị trong

một dung môi isopropanol tinh khiết và Acetonitril tỉ lệ 1:4 (được sản xuất bằng sắc

ký lỏng cao áp). Hỗn hợp phản ứng chứa 80 µl ƿ – nitrophenyl palmitate dung dịch

stock, 20 µl enzyme lipase và đệm Tris (0.05 M, pH 8.5) tạo thành dung dịch với thế

tích 3 ml.

Hỗn hợp phản ứng sẽ được ủ ở 55 oC trong 10 phút. Làm lạnh 20 oC ngừng phản

ứng trong 5 phút. Các enzyme sẽ bị bất hoạt ở nhiệt độ sôi trong 5 phút và đem mẫu

đi đo OD. Lượng ƿ – nitrophenol sinh ra được tính bằng millimoles (mM) ở A410.

Nồng độ ƿ – nitrophenol chưa biết sẽ được xác định thông qua đường chuẩn ƿ –

nitrophenol (2-20 µg/ml trong 0.05M đệm Tris pH 8.0).

Một đơn vị hoạt tính enzyme được xác định bằng lượng enzyme giải

phóng 1 micromol p-nitrophenol trong 1 phút (Gupta, 2002).



a: µmol p-nitrophenol được giải phóng trong 1 ml

V: thể tích phản ứng (ml)

t: thời gian phản ứng (phút)

v: thể tích enzyme (µl)

1000: quy đổi ra ml từ thể tích enzyme

4.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lypase trên đĩa thạch.



Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào trên môi trường LB – agar có bổ

sung cơ chất thích hợp.

Đục lỗ với đường kính 6mm trên bề mặt đĩa thạch. Các lỗ đục cách thành đĩa

petri khoảng 1cm để có thể quan sát được vòng phân giải cơ chất của enzyme. Hút

100µl dịch enzyme lên đĩa mơi trường LB – agar có bổ sung cơ chất: dầu oliu hoặc



13



Tween 80. Ủ các đĩa khảo sát ở 37 oC 12 giờ và quan sát vòng phân giải trên đĩa

(Nguyễn Văn Phúc, 2014).



Hình: Vong phân giải enzyme Lipase trên đĩa thạch



14



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

2 Phương pháp định tính enzyme cellulase trên đĩa thạch.

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×