Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
1 Phương pháp đường khử DNS (Theo tiêu chủng quốc gia TCVN, 2017)

1 Phương pháp đường khử DNS (Theo tiêu chủng quốc gia TCVN, 2017)

Tải bản đầy đủ - 0trang

màu là phenolphtelein. Nếu lượng HCl sử dụng từ 5mL đến 6mL trong chuẩn

độ dung dịch DNS để dung dịch chuyển từ màu đỏ sang không màu là đạt yêu

cầu. Nếu lượng HCl sử dụng nằm ngoài phạm vi trên, cần pha lại dung dịch





thuốc thử DNS.

Cách thực hiện

Dung dịch chuẩn gốc glucose,nồng độ 10 mg/mL

Cân 2,0g glucose khan, cho vào bình định mức dung tích 200 mL. Thêm



đệm citrate, pH 4,8 đến vạch định mức, lắc đều. Dung dịch chuẩn gốc glucose

được sử dụng ngay sau khi pha hoặc đậy chặt nắp và giữ trong tủ đông (dung

dịch cần lắc kỹ sau khi rã đông).

Dung dịch chuẩn glucose

Chuẩn bị 4 ống eppendorf, dung tích 10,0 mL, đánh số thứ tự từ 1 đến 4.

Dùng micropipet hút lần lượt dung dịch chuẩn gốc glucose và dung dịch đệm

citrate 0,05 M, pH 4,8 vào mỗi ống eppendorf theo Bảng 1.

Bảng 1 - Hướng dẫn pha dung dịch chuẩn glucose

ST



Thể tích dung dịch



Thể tích dung dịch



Nồng độ dung



T



chuẩn gốc glucose cho



đệm xitrat 0,05 M; pH



dịch chuẩn



vào mỗi ống eppendof



4,8 cho vào mỗi ống



glucose



1



(mL)

1,0



eppendof (mL)

0,5



(mg/mL)

6,7



2



1,0



1,0



5,0



3



1,0



2,0



3,3



4



1,0



4,0



2,0



Thang chuẩn glucose

Chuẩn bị thang chuẩn glucose

+ Lấy 0,5 mL dung dịch chuẩn glucose có các nồng độ glucose lần lượt



là 6,7; 5,0; 3,3; 2,0mg glucose/mL cho vào ống nghiệm có nắp chứa



8



1,0mL đệm citrate 0,05 M, pH 4,8. Ủ trong bể cách thủy ở 50 oC trong

60 phút.

+ Lấy các ống nghiệm ở trên khỏi bể cách thủy thêm 3 mL dung dịch



thuốc thử DNS vào mỗi ống nghiệm và trộn đều.

+ Mẫu trắng: Lấy 0,5mL nước cất cho vào ống nghiệm chứa 3mL dung



dịch thuốc thử DNS.

+ Đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng.



Dựng đường chuẩn glucose

Sau 20 phút, đo độ hấp thụ quang của thang chuẩn bằng máy quang phổ ở

bước sóng 540 nm.

Lập đồ thị đường chuẩn (hoặc phương trình tương đương) biểu thị tương

quan giữa độ hấp thụ (A) và nồng độ C (mg/0,5mL) của dung dịch chuẩn glucose.

Xác định hoạt độ cellulase

+ Lấy dịch nuôi cấy vi sinh vật cho vào ống ly tâm ly tâm trên máy ly



tâm trong 15phút, với tốc độ từ 5.000 vòng/phút đến 6.000 vòng/ phút

nhiệt độ 4oC.

+ Tách phần dịch trong phía trên bề mặt ống sau khi ly tâm, thu được



dịch enzyme cellulase thô, giữ ở nhiệt độ 4 oC.

+ Cuộn tròn miếng giấy lọc cho vào ống nghiệm có nắp đã chuẩn bị



sẵn.

+ Thêm 1,0mL dung dịch đệm citrate 0,05M, pH 4,8 vào ống nghiệm



sao cho dung dịch đệm phải ngập miếng giấy lọc.

+ Bổ sung 0,5mL dịch enzyme cellulase thô, lắc nhẹ. Ủ trong bể cách



thủy ở 50 oC trong 60 phút.

+ Thêm 3,0mL dung dịch thuốc thử DNS trộn đều, đun sôi cách thủy



trong 5 phút.

9



+ Làm lạnh nhanh, sau đó bổ sung 20mL nước cất trộn đều bằng cách



đảo ngược ống nghiệm nhiều lần.

+ Sau ít nhất 20 phút, dung dịch xuất hiện màu lục, tiến hành đo độ hấp



thụ trên máy quang phổ ở bước sóng 540 nm.

+ Mẫu trắng được thực hiện như cách trên nhưng thay 0,5mL dịch



enzyme thô bằng 0,5mL dung dịch đệm citrate 0,05M. Mẫu trắng

được sử dụng để chỉnh mật độ quang về giá trị 0.

+ Dựa vào đường chuẩn để tính nồng độ đường glucose và nồng độ



cellulase có trong dung dịch.

+ Từ đồ thị của đường chuẩn, xác định được nồng độ cellulase thích



hợp để giải phóng 2mg đường glucose trong thời gian 60 phút.

Hoạt độ cellulase tính theo đơn vị giấy lọc (FPA) được tính theo cơng thức

sau:



Trong đó:

FPA: Hoạt độ cellulase, tính bằng đơn vị giấy lọc trên ml (FPU/mL)

C: Nồng độ cellulase thích hợp để giải phóng 2mg glucose (mg/mL)

d: Hệ số pha lỗng cellulase thích hợp để giải phóng 2mg glulose; 0,37 Nồng

độ cellulase giải phóng 2mg glucose ở điều kiện tiêu chuẩn.

3.2 Phương pháp định tính enzyme cellulase trên đĩa thạch.



Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào trên môi trường LB – agar có bổ

sung cơ chất thích hợp.

Đục lỗ với đường kính 6mm trên bề mặt đĩa thạch. Các lỗ đục cách thành đĩa

petri khoảng 1cm để có thể quan sát được vòng phân giải cơ chất của enzyme. Hút

100µl dịch enzyme lên đĩa mơi trường LB – agar có bổ sung cơ chất: 0,5% CMC

(carboxy methyl cellulose),

10



Ủ các đĩa khảo sát ở 37 oC 12 giờ và quan sát vòng phân giải trên đĩa (Nguyễn

Văn Phúc, 2014).

Nêú vòng phân giải trên đĩa thạch bị mờ có thể cho thuốc thử lugol vào đĩa để

dễ quan sát vòng phân giải.



Hình: Vòng phân gải CMC của enzyme cellulase trên dĩa thạch với thuốc thử

logol

3.3 Định tính cellulase bằng phương pháp nhuộm Congo đỏ (Jonh N., 1985)

-



Chuẩn bị:

Đệm phosphat 0.5 M pH 7,0

Dung dịch Congo đỏ 1%

NaCl 1M



-



Tiến hành:



+



Vi khuẩn sau khi phân lập được pha lỗng và ni cấy trên mơi trường chọn

lọc ở điều kiện 37oC trong 20h để tạo dịch enzyme.

11



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

1 Phương pháp đường khử DNS (Theo tiêu chủng quốc gia TCVN, 2017)

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×