Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
1 Phương pháp xác định lượng đường khử DNS

1 Phương pháp xác định lượng đường khử DNS

Tải bản đầy đủ - 0trang

DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3-amino-5nitrosalicylic có màu đỏ cam bởi glucose.

• Hóa chất

Tinh bột 1%: Cân 1g tinh bột cho vào khoảng 60ml đệm citrate phosphate

0.2M pH 6.5. Đun tới khi tinh bột tan hoàn toàn. Định mức lên 100ml bằng đêm

citrate phosphate.

Thuốc thử DNS:

o 10g DNS vào 400ml nước cất khuấy tan.

o Cân 16g NaOH trong 150ml nước cất, khuấy tan. Thêm từ từ dung dịch

NaOH vào dung dịch DNS trên.

o Thêm 300g Na-K tartarate khuấy đến khi tan hết.

o Định mức đủ 1 lít bằng nước cất.

• Cách thực hiện

Dựng đường chuẩn:

Chuẩn bị dãy nồng độ glucose từ 0.05-1 mg/ml trong đệm citrate phosphate

0.2M pH 6.5.

Hút 6ml glucose vào các ống nghiệm tương ứng, cho 2ml thuốc thử DNS vào,

đun sôi trong 5 phút, để nguội. Đo mật độ quang ở bước sóng 540nm.

Vẽ đồ thị thể hiện mối tương quan giữa độ hấp thụ quang học và nồng độ

glucose trong dung dịch.

Xác định hoạt tính:

Canh trường sau khi ni cấy 24h, tiến hành đo hoạt lực enzyme:

Mẫu Thí Nghiệm

Mẫu Đối chứng

Hút 3ml dung dịch enzyme thô cho vào ống nghiệm

Đun sôi trong 20 phút, để nguội.

Thêm vào 3ml dung dịch

Thêm vào 3ml dung dịch tinh

tinh bột 1%

bột 1%

0

Ủ ở nhiệt độ 50 C trong 30 phút

Cho 2ml thuốc thử DNS vào, đun sôi trong 5 phút, để nguội

Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 540nm

Lấy hiệu số của các giá trị đo mật độ quang giữa mẫu thí nghiệm và mẫu đối

chứng đối chiếu đồ thị chuẩn, tính ra số µg/ml glucose tương ứng.

Một đơn vị đơn vị hoạt tính Amylase (1UI/ml) là lượng µmol glucose được

giải phóng ra dưới tác dụng của 1ml enzyme trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm.

Do đó hoạt tính amylase trong một ml (hay gam) enzyme chế phẩm là:

4



HA/ml= x d µmol/phút.ml(UI/ml)

Trong đó:

a: Lượng glucose được giải phóng ra từ tinh bột dưới tác dụng của Amylase

µg/ml.

v: thể tích enzyme thô tham gia phản ứng (ml)

t: thời gian phản ứng (phút)

d: độ pha loãng của chế phẩm enzyme trước khi đem phân tích

2.2 Phương pháp Nelson - Somogyi (NS) (Nelson T., 1944).



Thuốc thử A

• 180 g Na2SO4

• 12 g kali natri tartrat

• 24 g Na2CO3 (khan)

• 4 g CuSO4 x 5 H2O hoặc 2,6 g CuSO4

• 16 g NaHCO3

Chuẩn bị:



-



-



Hòa tan 12g kali natri tartrat và 24g Na 2CO3 trong 250ml H2O. Tiếp theo



-



là thêm 4g CuSO4 x 5H2O,16g NaHCO3.

Hòa tan 180g Na2SO4 trong 500ml nước sơi H2O và đun sơi để loại bỏ



bọt khí.

- Hai dung dịch được pha trộn và lọc để có được một dung dịch A.

Thuốc thử Nelson:

25g (NH4)2MoO4 x 2H2O hoặc 25,75g (NH4)6Mo7O24 x 4H2O

21ml H2SO4

3g AsHNa2O4 x 7H2O



Chuẩn bị:

• Hòa tan 25g (NH4)2MoO4 x 2H2O hoặc 25,75 g (NH4)6Mo7O24 x 4H2O trong

450ml H2O và thêm 21ml H2SO4 (cơ đặc).

• Hòa tan 3g AsHNa2O4 x 7H2O trong 25ml H2O

• Trộn đều thuốc thử và ủ 30 phút ở 55°C

Nguyên tắc:

5



Phương pháp Nelson-Somogyi là một trong những phương pháp cổ điển và

được sử dụng rộng rãi để xác định định lượng đường khử. Phương pháp này sử dụng

các tính chất khử (vì sự có mặt của một nhóm aldehyde) của một số loại

carbohydrate nhất định. Xác định đường giảm sử dụng Somogyi-Nelson dựa trên độ

hấp thụ ở bước sóng 520 nm của một phức hợp màu giữa đường oxy hóa đồng và

arsenomolybdate.

Cách thực hiện:

1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn Glucose trong nước cất từ 0-0,50 µmol/ml.

2. Lấy 1ml các nồng độ chuẩn, ống sử dụng làm mẫu trắng, thêm 1ml nước cất.

3. Chuẩn bị các mẫu dung dịch enzyme amylase.

4. Thêm 1ml thuốc thử A vào mỗi ống và lắc đều.

5. Đặt các ống trong nước sôi trong 10 phút

6. Làm nguội ống đến nhiệt độ phòng và thêm 1mL arsenomolybdat thuốc thử

Nelson cho tất cả các ống.

7. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm.

2.3 Phương pháp định tính enzyme trên đĩa thạch.



Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào trên môi trường LB – agar có bổ

sung cơ chất thích hợp.

Đục lỗ với đường kính 6mm trên bề mặt đĩa thạch. Các lỗ đục cách thành đĩa

petri khoảng 1cm để có thể quan sát được vòng phân giải cơ chất của enzyme . Hút

100µl dịch enzyme lên đĩa mơi trường LB – agar có bổ sung cơ chất: 1% tinh bột. Ủ

các đĩa khảo sát ở 37oC 12 giờ và quan sát vòng phân giải trên đĩa (Nguyễn Văn

Phúc, 2014).

Nêú vòng phân giải trên đĩa thạch bị mờ có thể cho thuốc thử lugol vào đĩa để

dễ quan sát vòng phân giải.



6



Hình: Vòng phân giải cơ chất tinh bột của enzyme amylase với thuốc thử lugol.

3 CELLULASE

3.1 Phương pháp đường khử DNS (Theo tiêu chủng quốc gia TCVN, 2017)





Nguyên tắc

Cellulase được xác định theo phương pháp xác định lượng đường khử DNS: Giấy



lọc bị thủy phân trong môi trường acid dưới tác dụng của cellulase tạo thành sản phẩm

là các phân tử đường glucose. Lượng glucose này được xác định bằng thuốc thử 3,5dinitrosalicylic acid (DNS).

DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3-amino-5nitrosalicylic có màu đỏ cam bởi glucose.

• Hóa chất

o Giấy lọc Whatman kích thước 1cm x 6cm (50mg)

o Đệm sodium citrate 0.05M pH 4.8: Cân 210g acid citric thêm vào 750ml

nước cất, khuấy tan. Thêm NaOH cho đến khi pH 4.8, sau đó thêm nước cất

vừa đủ 1 lít được dung dịch đệm sodium citrate 1M. Pha loãng thành đệm

o



sodium citrate 0.05M pH 4.8.

Thuốc thử DNS: Cân 10.6 g DNS, thêm vào 1416 ml nước cất, thêm vào 19.8g

NaOH, khuấy tan. Sau đó thêm 306g Na-K tartarate, 7.6ml phenol và 8.3g

Na2S2O5. Lấy 3ml thuốc thử vừa chuẩn bị chuẩn độ với 0.1N HCl, chất chỉ thị

7



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

1 Phương pháp xác định lượng đường khử DNS

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×