Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
- Mục đích: Chọn hệ dung môi có khả năng tách các thành phần trong dịch chiết tốt nhất để chạy cột, tinh chế KS. Xác định các thành phần trong dịch chiết DMHC.

- Mục đích: Chọn hệ dung môi có khả năng tách các thành phần trong dịch chiết tốt nhất để chạy cột, tinh chế KS. Xác định các thành phần trong dịch chiết DMHC.

Tải bản đầy đủ - 0trang

Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

32



- Mục đích: Tinh chế, loại tạp nhằm thu KS tinh khiết.

- Tiến hành: Dịch lọc của dịch lên men gộp lại được khoảng 6,1 lít, đem chiết bằng n

– butanol ở pH 3 thu được 820 ml dung môi hữu cơ. Lượng dung môi này mang cất

quay bằng máy cất chân không Buchi Waterbath, thu được 0,3594 (g) bột kháng sinh

thô.

3.9.1. Kết quả cột sắc ký lần 1

Cho bột kháng sinh thô chạy qua cột Silicagel với hệ 3 - dung môi Butylacetat:

ethanol: triethylamin tỷ lệ (1:2:1). Lấy 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml vào ống

nghiệm sạch.Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc (trên P.

mirabilis).Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng 14 và hình 3.11.

Bảng 14: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1

Phân đoạn



D (mm)



s



Phân đoạn



D (mm)



s



1



0,00



0,00



16



16,86



0,80



2



7,90



0,46



17



15,73



0,81



3



10,73



0,64



18



13,72



1,10



4



10,87



0,32



19



12,40



0,53



5



11,50



1,32



20



12,02



0,47



6



12,10



1,38



21



11,51



0,50



7



12,26



1,10



22



11,16



0,29



8



14,13



1,02



23



10,42



1,21



9



18,16



1,25



24



9,73



1,27



10



18,56



0,81



25



9,06



1,01



11



19,76



0,85



26



7,90



0,79



12



20,46



0,55



27



6,13



0,81



13



22,53



0,50



28



0,00



0,00



14



20,86



0,80



29



0,00



0,00



33



15



19,93



0,90



30



0,00



0,00



Hình 3.11 dưới đây thể hiện sự thay đổi HTKS theo từng phân đoạn:



Hình 3.11: Sắc ký cột lần 1

Cảm quan: Phân đoạn 2 đến 8 và 15 đến 23 có màu vàng rất nhạt, phân đoạn 9

đến 14 có màu đỏ cam, còn các phân đoạn khác khơng màu.

Nhận xét:

Khả năng tách của hệ chưa được tốt. Có ít nhất 2 chất có HTKS trong bột kháng

sinh thơ thu được.

Tiến hành sắc ký lớp mỏng các phân đoạn có HTKS cao nhất từ 8 đến 15, kết

quả Rf = 0,64 và vết sắc ký có dạng vệt dài hình ngọn đuốc. Chứng tỏ hệ 3 không tách

được các thành phần trong các phân đoạn này, phải chọn hệ dung môi khác để tách tiếp

các thành phần trong KS thu được.

Tạm thời chia các phân đoạn sắc ký thành 3 nhóm dựa trên HTKS:

- Nhóm 1: từ phân đoạn 2 đến 5,

- Nhóm 2: từ phân đoạn 6 đến 14,

- Nhóm 3: từ phân đoạn 15 đến 27.

Tiến hành sắc ký lớp mỏng các phân đoạn với hệ dung môi ethylacetat :

methanol (tỷ lệ 11:1)thu được kết quả ở bảng dưới đây:

Bảng 15: Kết quả sắc ký lớp mỏng phân đoạn các nhóm 1, 2, 3.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

34



Phân đoạn

2–5



6 – 14



15 – 27



KQ

0,32



0,48



0,48



Rf1



vết nhạt, màu hồng



vết đậm, màu vàng



vết nhạt, màu vàng



Rf2



-



0,64



0,64



vết nhạt, màu vàng



vết đậm, màu vàng



Từ kết quả sắc ký đồ, ta có thể thấy nhóm 1: phân đoạn 2 – 5 đã được tách

riêng, từ HTKS có thể thấy đây là thành phần phụ. Nhóm 2 và 3 gồm ít nhất 2 thành

phần KS.

Gộp dịch phân đoạn 2 – 5, đem cô, sấy và cân thu được KS0, m0 = 0,0002 (g).

Hiệu suất tinh chế: ΣH0 = 0,05 %

3.9.2. Chạy cột sắc ký lần 2

 Tiến hành sắc ký cột nhóm 2:

Gộp dịch từ phân đoạn 6 đến 14, cô chân không đến kết tinh, thu được 0,1895 (g) bột,

chạy cột sắc ký lần 2 với hệ dung môi ethylacetat : n – hexan : methanol(11:1:1)

Lấy 36 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1,5 ml vào ống nghiệm sạch. Thử HTKS từng phân

đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc.

Kết quả được thể hiện ở bảng dưới đây:

Bảng 16: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 – nhóm 2.

Phân đoạn



D (mm)



s



Phân đoạn



D (mm)



s



1



0,00



0,00



19



21,54



0,84



2



11,33



0,15



20



20,32



0,65



3



13,24



0,32



21



18,75



0,23



4



14,02



0,78



22



15,39



1,35



5



18,41



0,93



23



14,03



0,82



35



6



17,64



1,21



24



12,81



0,37



7



12,15



0,91



25



9,73



0,54



8



9,45



0,36



26



0,00



0,00



9



0,00



0,00



27



18,58



0,65



10



0,00



0,00



28



24,67



0,31



11



0,00



0,00



29



24,26



0,78



12



13,56



1,17



30



20,73



0,91



13



17,86



1,29



31



16,06



0,34



14



19,24



0,46



32



14,27



1,15



15



23,38



0,95



33



12,08



0,81



16



23,92



0,55



34



11,67



0,79



17



22,17



1,25



35



0,00



0,00



18



21,19



0,69



36



0,00



0,00



Hình 3.12 dưới đây biễu diễn cụ thể sự thay đổi HTKS của thành phần KS qua từng

phân đoạn.



Hình 3.12: Sắc ký cột lần 2 – nhóm 2.

Nhận xét: Hệ sắc ký tách ra thành các thành phần khá rõ. Dựa vào các đỉnh

trên hình 13 tiến hành sắc ký lớp mỏng đối với các phân đoạn 1, 5, 7, 12, 16, 20, 24,

27, 30, 34 hệ dung môi chạy là hệ ethylacetat : methanol (11:1). Hiện hình VSV bằng

P. mirabilis.Kết quả được thể hiện ở bảng 17.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

36



Bảng 17: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột nhóm 2

Phân đoạn



Rf1



Rf2



1



0,63



-



5



0,63



-



7



0,63



-



12



0,63



0,42



16



0,63



0,42



20



0,63



0,42



24



0,63



0,42



26



-



0,42



30



-



0,42



34



-



0,42



Nhận xét:

Từ kết quả thử HTKS và sắc ký đồ các phân đoạn, ta có thể phân thành 3 nhóm:

-



Nhóm 1: từ phân đoạn 2 đến 8 (có 1 thành phần KS1)



-



Nhóm 2: từ phân đoạn 12 đến 25 (có 2 thành phần KS1 và KS2 hay phần

xen phủ)



-



Nhóm 3: từ phân đoạn 26 đến 34 (có 1 thành phần KS2)



Gộp các phân đoạn từng nhóm, đem cơ chân không, kết tinh được:

- KS1: m1 = 0,0106 (g). KS phụ, màu đỏ. Hiệu suất tinh chế H1 = 5,59 %

- KS2: m2 = 0,0206 (g). Đây là thành phần chính.KS có màu đỏ cam. Hiệu suất tinh

chế kháng sinh H2 = 10,89%.

- Phần xen phủ: mxf = 0,1047 (g)

 Tiến hành sắc ký cột nhóm 3:

Gộp dịch từ phân đoạn 15 đến 27, cô chân không đến kết tinh, thu được 0,1186

(g) bột, chạy cột sắc ký lần 3 với hệ dung môi ethylacetat : n – hexan :



37



methanol(11:1:1) Lấy 36 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1,5 ml vào ống nghiệm sạch.

Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được thể hiện

ở bảng dưới đây:

Bảng 18: Kết quả sau chạy cột lần 2 - nhóm 3

Phân đoạn



D (mm)



s



Phân đoạn



D (mm)



s



1



0,00



0,00



19



22,60



0,72



2



12,42



0,18



20



21,57



0,65



3



13,07



1,32



21



20,75



1,23



4



14,16



0,15



22



16,39



1,35



5



16,28



0,73



23



15,03



0,37



6



17,14



0,65



24



10,61



0,59



7



14,35



0,71



25



9,18



0,43



8



10,28



1,21



26



9,07



0,06



9



9,40



0,54



27



0,00



0,00



10



0,00



0,00



28



0,00



0,00



11



0,00



0,00



29



18,29



0,98



12



10,06



1,15



30



23,45



1,07



13



15,74



0,34



31



20,08



0,37



14



16,27



0,45



32



18,27



0,35



15



19,31



0,92



33



13,02



0,81



16



23,32



0,65



34



11,26



1,19



17



24,21



0,53



35



9,02



0,60



18



24,19



0,79



36



0,00



0,00



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

38



Hình 3.13: Sắc ký cột lần 2 – nhóm 3.

Nhận xét: Hệ sắc ký tách ra thành các thành phần khá rõ. Dựa vào các đỉnh

trên hình 3.13 tiến hành sắc ký lớp mỏng đối với các phân đoạn 2, 6, 9, 12, 18, 24, 29,

30, 35; hệ dung mơi chạy là hệ ethylacetat : methanol (11:1). Hiện hình VSV bằng P.

mirabilis.Kết quả được thể hiện ở bảng 19.

Bảng 19: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột nhóm 3.

Phân đoạn



Rf1



Rf2



2



0,63



-



6



0,63



-



9



0,63



-



12



0,63



0,42



18



0,63



0,42



24



0,63



0,42



29



-



0,42



30



-



0,42



35



-



0,42



Nhận xét:

- Nhóm 1: từ phân đoạn 1 đến 10 (1 thành phần KS1)

- Nhóm 2: từ phân đoạn 11 đến 27 (2 thành phần KS1 và KS2 hay phần xen phủ)

- Nhóm 3: từ phân đoạn 28 đến 36 (1 thành phần KS2)

Gộp các phân đoạn từng nhóm, đem cơ chân khơng, kết tinh được:

KS1: m1’= 0,0125 (g). Hiệu suất tinh chế H1’ = 8,64 %



39



KS2: m2’ = 0,0182 (g). Đây là thành phần KS chính, màu đỏ cam. Hiệu suất tinh

chế kháng sinh H2’= 15,34%

Phần xen phủ còn lại: mxf’ = 0,1058 (g)

Vậy, sau q trình tinh chế đã tách riêng được các thành phần KS như sau:

 KS0: KS phụ, màu hồng, m0 = 0,0002 (g). Hiệu suất ΣH0 = 0,05 %

 KS1: KS phụ, màu đỏ, Σm1 = 0,0231 (g). Hiệu suất ΣH1 = H1 + H1’ = 14,23 %

 KS2: KS chính, màu đỏ cam, Σm2 = 0,0388 (g).

Hiệu suất quá trình tinh chế: ΣH2 = H2 + H2’= 26,23 %

Tổng hiệu suất quá trình tinh chế: ΣH0 + ΣH1 + ΣH2 = 40,51 %

Tiếp tục tiến hành đo phổ UV, IR, MS và nhiệt độ nóng chảy của chất KS2.

 Phần xen phủ: Σmxf = 0,2105 (g).

3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết

- Nhiệt độ nóng chảy của KS: 198,2°C

- Phổ tử ngoại: cho các đỉnh hấp thụ ở: 230,00 nm, 211,00 nm và 442,00 nm. Từ

đó, ta dự đốn cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, hoặc kết hợp các đặc

điểm trên.

- Phổ hồng ngoại: phổ IR cho thấy các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức

dự đốn tương ứng được trình bày trong bảng 20.

Bảng 20: Kết quả IR

λ (nm)



Nhóm chức đặc trưng



λ (nm)



Nhóm chức đặc trưng



609



Alkyl clorid (R-Cl)



1630



Amid (R-C=O-NR’R’’)



1097; 1195



Alkyl fluorid (R-F)



1585



Nitro (-NO2)



1743



Ester (R-CO-OR’);



3432



Amin (>N-H)



1362



Sulfonat ester (-SO2-O-)



Anhydrid acid (R-CO)2O

1484



Imin (>C=N-)



- Phổ khối: Phân tử lượng của KS2 1255,42 đvC.

Từ các kết quả biện giải sơ bộ, có thể dự đốn KS2 liên quan tới Actinomycin D.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

40



KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

1. KẾT LUẬN

Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tơi đã cơ bản hồn thành được mục tiêu ban đầu

của khóa luận tốt nghiệp. Các kết luận cụ thể như sau:

1. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 156.11sau quá trình cải

tạo giống tăng lên rõ rệt (19,29%).

2. MT2dt là mơi trường thích hợp nhất cho Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp

kháng sinh, biến chủng sau ĐB2 có khả năng sinh tổng hợp KS mạnh nhất.

3. Tách chiết, tinh chế: n – butanol ở pH = 3 là dung mơi chiết xuất thích hợp,

sử dụng hệ dung mơi butylacetat : ethanol : triethylamin (1:2:1) và hệ ethylacetat : nhexan: methanol (11:1:1) để tách thành phần kháng sinh.

4. Kháng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp có một số đặc điểm như

sau:

+ Phổ tác dụng rộng, trên cả vi khuẩn Gram(+) và vi khuẩn Gram(-)

+ Tách riêng được 3 thành phần trong kháng sinh thô thu được KS0, KS1, KS2.

Trong đó, KS2 là thành phần KS chính.

+ Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt40,51%

+ Kháng sinh KS2 tinh khiết có nhiệt độ nóng chảy 198,2ºC, hấp thụ ánh sáng

tử ngoại, hồng ngoại. Cấu trúc phân tử kháng sinh được dự đốn có thể chứa nhân

thơm, nối đơi liên hợp, dị tố; các nhóm chức có trong kháng sinh là: ester, alkyl clorid,

alkyl flourid, imin, amin, nitro, amid.

2. ĐỀ XUẤT

Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên

cứu sâu hơn theo các hướng sau:

- Tiến hành giải trình tự gen để xác định chính xác tên khoa học của

Streptomyces 156.11



41



- Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 156.11(bằng UV, bằng hóa chất, …) để

tạo ra chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao hơn.

- Khảo sát tìm điều kiện lên men tối ưu.

- Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách để tạo ra kháng sinh với độ tinh khiết

và hiệu suất cao hơn. Chiết tách để thu lấy các kháng sinh phụ và nghiên cứu sâu hơn.

- Tiến hành phổ khối, cộng hưởng từ hạt nhân, xác định các tính chất lý, hóa, …

để xác định chính xác cấu trúc hóa học và tên khoa học của kháng sinh do

Streptomyces 156.11sinh tổng hợp.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt:

1. Bộ Y Tế (2008),Dược lý học tập 2, NXBY học, Hà Nội.

2. Bộ Y Tế (2008),Hóa phân tích tập 2, NXB Y học, Hà Nội.

3. Bộ Y Tế (2008),Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập II,, NXB Y học,

Hà Nội.

4. Bộ Y Tế (2009),Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội.

5. Bộ Y Tế (2008),Vi sinh vật họcNXB Giáo dục, Hà Nội, trang 26 –

36, 80 – 95.

6. Trần Thị Hồng Anh (1993),Quang phổ hấp thụ tử ngoại– khả kiến

và ứng dụng trong định lượng kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật.

7. Nguyễn Văn Cách (2008),Công nghệ lên men kháng sinh, NXB

Khoa học và kỹ thuật.

8. Nguyễn Lân Dũng (2001),Vi sinh vật học,NXB Giáo dục, tr. 39–

67.

9. Phạm Thị Lam Giang (2011),Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng

sinh từ Streptomyces 156.11, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2006 – 2011,

Trường Đại học Dược Hà Nội.

10. Hy Thanh Hà (2001), Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh và

phản ứng có hại của kháng sinh tại một số khoa bệnh viện Bạch Mai từ 1998

– 2000, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 1996 – 2001, Trường Đại học

Dược Hà Nội.

11. Đoàn Thị Nguyện (2009),Vi sinh vật, NXB Giáo dục Việt Nam, tr.

7–37.

12. Lương Đức Phẩm (1999),Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông

nghiệp.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

- Mục đích: Chọn hệ dung môi có khả năng tách các thành phần trong dịch chiết tốt nhất để chạy cột, tinh chế KS. Xác định các thành phần trong dịch chiết DMHC.

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×