Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Hình P.14: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau 5 - 6 ngày.

Hình P.14: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau 5 - 6 ngày.

Tải bản đầy đủ - 0trang

Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi



1



ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nhiệt đới nóng ẩm với nền kinh tế đang phát triển, nằm trong

khu vực có tỷ lệ bệnh nhiễm trùng cao nên nước ta có nhu cầu sử dụng kháng sinh rất lớn.

Do nhiều nguyên nhân, tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh ngày càng diễn

biến phức tạp và đang là mối lo ngại của cả xã hội, chúng ta đã và đang phải đối mặt với

“kỉ nguyên hậu kháng sinh”. Tuy nhiên, hầu hết các kháng sinh trên thị trường dược phẩm

trong nước vẫn còn được nhập ngoại dưới dạng nguyên liệu, bán thành phẩm hay thành

phẩm. Chính vì vậy, nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh nước ta

là: một mặt cải tiến các chất kháng sinh cũ và phát triển công nghệ sản xuất kháng sinh,

mặt khác phải thúc đẩy việc tìm ra kháng sinh mới. Đây là yêu cầu tất yếu và cấp thiết

trong công cuộc bảo vệ và chăm sóc sức khỏe nhân dân.

Trong các phương pháp sản xuất kháng sinh, bên cạnh tổng hợp và bán tổng

hợp, phương pháp phân lập kháng sinh từ xạ khuẩn vẫn là con đường quan trọng để tìm

được các chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và từ đó phát hiện hoạt chất mới.

Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ

Streptomyces. Bộ mơn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu và

bước đầu có kết quả với chi xạ khuẩn Streptomyces. Chính vì vậy, chúng tơi lựa chọn đề

tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờStreptomyces156.11” làm

luận văn tốt nghiệp với các mục tiêu sau:

1. Nghiên cứu cải tạo giống nâng cao năng suất sinh tổng hợp kháng sinh.

2. Lựa chọn môi trường và biến chủng thích hợp cho q trình lên men.

3. Tách chiết và tinh chế để thu được kháng sinh tinh khiết.

4. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

2



Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Đại cương về kháng sinh

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh

Chất kháng sinh (antibiotic) trước đây gọi là chất kháng khuẩn (antimicrobic) - là

thuốc được con người dùng chủ yếu để chữa các bệnh nhiễm khuẩn [21]. Cho đến nửa

sau thế kỷ XIX người ta đã xác định được vi sinh vật là nguyên nhân gây ra hàng loạt

các bệnh này. Do đó liệu pháp hoá học nhằm vào vi sinh vật gây bệnh trở thành liệu

pháp điều trị chính.

Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Flemming đã tình cờ phát hiện

hiện tượng nấm mọc trên đĩa và quanh tảng nấm đó là những vòng diệt khuẩn. Năm

1929, ơng cơng bố penicillin trước công chúng.Năm 1938, Howara Walter Florey và

Ernst Boris Chaen đã chiết xuất được penicillin.Năm 1942, penicillin được áp dụng

vào điều trị.Ngay sau đó, penicillin đã trở thành một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu

sống hàng triệu chiến binh trong chiến tranh thế giới II.Từ những năm 1940 đến cuối

những năm 1960, nhiều kháng sinh mới được tìm ra và thời kỳ này được coi là một giai

đoạn vàng son của việc nghiên cứu kháng sinh. Năm 1944, streptomycin được phát

hiện từ vi khuẩn đất Streptomyces griseus[21].Sau đó đến chloramphenicol,

tetracycline, các kháng sinh nhóm macrolid và glycopeptides ... được tìm ra (tham

khảo phụ lục – hình 1.1). Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu được

nhiều kháng sinh phổ rộng hơn, hoạt tính kháng vi sinh vật cao hơn, như các kháng

sinh họ β – lactam... Cùng với việc tìm ra những kháng sinh mới, công nghệ lên men

sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện. Con đường tổng hợp và bán tổng

hợp cũng dần phát triển.

Việc phát hiện và phát triển kháng sinh của thế kỷ XX đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử

vong do nhiễm khuẩn. Song từ những năm 1980, những kháng sinh mới được phát hiện

và đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí quá lớn. Đồng thời, vi sinh vật nhanh kháng

thuốc và tốc độ đó lại nhanh hơn tốc độ tìm ra thuốc mới của con người. Vì vậy, việc



3



áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật dung hợp tế bào, tái tạo gen... là rất

quan trọng để giúp con người tìm ra các chủng có HTKS cao và phát hiện các loại

kháng sinh mới [10].

1.1.2. Định nghĩa kháng sinh

Theo quan niệm truyền thống, kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được

từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm

hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn,

nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [3, 5].

Hiện nay, kháng sinh được định nghĩa là những chất có nguồn gốc vi sinh vật,

được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học. Với liều thấp có tác dụng kìm hãm hoặc

tiêu diệt VSV gây bệnh [1]

1.1.3. Phân loại kháng sinh

Kháng sinh có thể phân loại theo nhiều cách, theo nguồn gốc, theo cấu trúc hố học,

theo cơ chế tác dụng, theo đích tác dụng...

Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia ra làm các nhóm chính sau đây

[1]:

1. Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin)

2. Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)

3. Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)

4. Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)

5. Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)

6. Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)

7. Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)

8. Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin)

9. Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (actinomycin D).

1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

4



Kháng sinh có một hay nhiều đích tác dụng trong tế bào vi sinh vật mẫn cảm, tuy

nhiên có thể khái qt thành 5 nhóm kháng sinh theo đích tác dụng chính (tham khảo

phụ lục – hình 1.2) [1].

1. Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn:β -lactam, vancomycin, bacitracin...

2. Thay đổi tính thấm màng tế bào chất: amphotericin, polymicin...

3. Ức chế tổng hợp acid nucleic: quinolon, rifampicin...

4. Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: chloramphenicol,

tetracyclin, macrolid...

5. Ức chế chuyển hóa: co-trimoxazol.

1.1.5. Ứng dụng của kháng sinh

 Trong lĩnh vực y học:

-



Kháng sinh được sử dụng rộng rãi, phổ biến để điều trị và phòng các bệnh

nhiễm khuẩn, ngồi ra còn điều trị ung thư, chống nấm.



 Lĩnh vực khác:

-



Trong chăn nuôi: Kháng sinh cũng được dùng để điều trị bệnh do vi sinh vật gây

ra trên động vật. Ví dụ: Griseoviridin dung điều trị bệnh viêm phổi cấp, viêm vú

của trâu bò...



-



Trong trồng trọt: Kháng sinh có thể diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây

trồng; ví dụ: Blastincidin, Validamycin...[3], [12]



1.1.6. Sơ đồ tổng quát quy trình lên men sản xuất kháng sinh

Các bước cơ bản trong quá trình lên men từ xạ khuẩn được thể hiện ở hình 1.3 phần

phụ lục. [3], [4], [8].

1.1.7. Kháng sinh chống ung thư

Ở sinh vật bậc cao, mỗi tế bào có chức năng nhất định được thực hiện trong mối tương

tác/liên hệ với các tế bào khác. Khi gặp điều kiện bất thường, tế bào mất liên hệ với các

tế bào xung quanh và phân chia không ngừng tạo thành cấu trúc khối u hay ung thư.

Ung thư được điều trị bằng một trong ba liệu pháp hoặc kết hợp các liệu pháp cùng



5



phẫu thuật để loại bỏ khối u, chiếu xạ để phá huỷ chọn lọc các tế bào ung thư hoặc hoá

trị. Nhiều chất hoá học dùng trong hoá trị liệu ung thư là sản phẩm bậc hai mà vi sinh

vật sinh ra do đó được gọi là kháng sinh chống/ kháng ung thư. Một số nhóm kháng

sinh đã được dùng trong điều trị ung thư là anthracycline, actinomycin, bleomycin... và

đạt được những kết quả khả quan.[16], [23]

1.1.8. Khái niệm về tính kháng kháng sinh

Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một

thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu [22].



Hình 1.4: Vi khuẩn kháng kháng sinh

Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận. Kháng thuốc

tự nhiên là đặc trưng của từng nòi sinh vật nhất định đối với một số kháng sinh nhất

định nào đó. Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính thấm thành tế bào, do các

enzyme vơ hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa các con đường

trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác dụng. [5]

1.2. Đại cương về xạ khuẩn

1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria)có cấu tạo dạng sợi

phân nhánh. Chúng phân bố rộng rãi và đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và

tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Tên xạ khuẩn bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

6



“actys” (tia) và “mykes” (nấm).Đa số xạ khuẩn có nguồn gốc từ đất. Trong mỗi gam

đất nói chung có tới hàng triệu xạ khuẩn [5].

Streptomyces là chủng phổ biến, chiếm tới 95% các chủng phân lập được.Xạ khuẩn có

thể được phân lập từ nước ngọt nhưng mật độ hiện diện thấp hơn. Các giống phổ biến

là Actinoplanes, Micromonospora... Nhiều giống xạ khuẩn đã được phân lập từ nước

biển và trầm tích biển bao gồm Streptomyces, Mocrobispora...[22]

Xạ khuẩn tổng hợp được nhiều chất có giá trị, đặc biệt là kháng sinh.Chúng sản sinh

một lượng lớn chất kháng sinh với những cấu trúc hóa học đa dạng. [3]

Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của q trình chuyển hóa, được tích lũy bên trong tế

bào (nội bào) hay phóng thích ra ngồi mơi trường (ngoại bào).Các chủng xạ khuẩn

cùng lồi có thể sản sinh các kháng sinh khác nhau, mặt khác, các chủng thuộc các lồi

khác nhau có thể sản xuất cùng một loại kháng sinh. Bảng 1 phần phụ lục đưa ra một

số kháng sinh do xạ khuẩn tổng hợp và ứng dụng của chúng.[13]

Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc.Khuẩn lạc xạ

khuẩn thường có dạng thơ ráp, dạng phấn, khơng trong suốt, có các nếp gấp toả ra theo

hình phóng xạ, đồng tâm hay chia thuỳ. Với hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và đa

số khơng có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Kích thước và

khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và ni cấy

(khoảng từ 0,3µm đến 2-3µm).Để hiểu rõ hiểu sự đa dạng của xạ khuẩn, hình 1.5 phần

phụ lục giới thiệu phân loại bộ Actinomycetales.[5]

1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn Streptomyces

Streptomyces là một chi thuộc họ Streptomytaceae, bộ Actinomycetales.

Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là

từ Streptomyces[8].

Dưới đây là các đặc điểm thường thấy ở xạ khuẩn Streptomyces:

Đặc điểm hình thái:Streptomyces phát triển thành dạng sợi, sợi nhỏ, dài. Mạng lưới

phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí



7



sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất.Hệ sợi chia làm 2 loại là khuẩn ty cơ chất

và khuẩn ty khí sinh [5].



Hình 1.6: Cấu trúc khuẩn ty của xạ khuẩn

cp – tế bào chất; cm – màng tế bào chất; cw – thành tế bào; me – mezoxom; se – vách

ngăn; ri – riboxom; re – chất dự trữ

Đặc điểm cấu tạo: Cấu tạo của Streptomyces chia làm ba phần: thành tế bào, màng tế

bào chất, tế bào chất. Trong đó thành tế bào xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I,

có chứa L – diaminopimelic acid ( L –ADP ) và glycin.

Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là VSV dị dưỡng và hơ hấp hiếu khí. Nhiệt độ phát

triển từ 20-40°C (thích hợp là 26-32°C), pH thích hợp là 6,8-7,5. Nguồn hydratcacbon

như tinh bột, glucose... Nguồn nitơ như muối nitrat, amoni...

Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia thành bốn loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của

khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh (màu sắc của bề mặt khuẩn lạc), sắc tố

melanoid.

1.2.3. Phương pháp phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces

- Qua đặc điểm hình thái: khóa phân loại ISP được sử dụng làm bảng phân loại

chính để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces dựa trên các đặc điểm: màu

khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, hình dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử, khả năng

tạo sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, khả năng tiêu thụ các nguồn đường. [5]

- Bằng sinh học phân tử: tách chiết ADN; phản ứng PCR, giải trình tự 16S rADN và

phân tích cây chủng loại phát sinh. [8]



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

8



1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên

Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần

khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20 - 40 % so với những cá thể khác.

Chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.[3]

Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban

đầu, nó khơng có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả năng

siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.[3],

[15]

1.3.2. Đột biến cải tạo giống

Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:

- Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), hydroxylamin,

dimethylsulphat…

- Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia neutron hay electron. Tác nhân vật lý

hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV).

- Tác nhân sinh học: Tác nhân sinh học biến đổi gen.

Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu

hết các vi sinh vật. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi

các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm

tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương) [8, 15]

Đặc biệt, hiệu quả của đột biến UV chịu tác động của các nhân tố: khoảng thời

gian giữa lúc chiếu xạ và lần sao chép tiếp theo của ADN, mức độ tổn thương ADN,

hoạt tính enzyme sửa chữa trong tế bào xạ khuẩn [15]

Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến

bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định hướng các

gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần.[3]

1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn



9



Bảo quản giữ giống VSV là công việc cần thiết do các giống rất dễ bị thối hóa, nhầm

lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học [3].

Thơng thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: cấy

chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường ở 2°C, định kỳ cấy chuyền sang môi

trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khơ ở nhiệt độ phòng),

đơng khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu

đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và

bảo quản ở nhiệt độ thấp) [8]

Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ

khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh ở

2°C và định kỳ 3 – 6 tháng cấy lại 1 lần [3].

1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật

nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất

trung gian cho chúng [3].

Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá

trình sinh trưởng củavi sinh vật, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng.



Hình 1.7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn.

1.4.1. Các phương pháp lên men



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

10



- Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay

thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi khơng khí để hơ

hấp trên bề mặt MT. Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao tác đơn giản, khơng đòi

hỏi thiết bị q tân tiến nhưng lại có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng

mơi trường thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men

bề mặt trong chọn giống và giữ giống.[3]

- Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3

chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng đòi

hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn. [3], [7]

1.4.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình lên men

-pH mơi trường: ảnh hưởng đến q trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp

của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là tác

dụng gián tiếp.

- Độ hòa tan oxy và sự thơng khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất

trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng

oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thơng khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút

ngắn pha tiếm phát. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai đoạn sinh

trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan oxy

lớn nên thơng khí mạnh là tốt.[3]

Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới

quá trình lên men để có thể tối ưu hóa q trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất

cho sinh tổng hợp chất mong muốn.[3], [7]

1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh

Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên

men thường khơng bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường

thấp.[3], [12]



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Hình P.14: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau 5 - 6 ngày.

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×