Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Nhận xét: Chủng streptomyces 155.29 khá bền với nhiệt độ, hoạt tính kháng sinh hầu như không thay đổi.

Nhận xét: Chủng streptomyces 155.29 khá bền với nhiệt độ, hoạt tính kháng sinh hầu như không thay đổi.

Tải bản đầy đủ - 0trang

Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

34



3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi

Dịch chiết dung môi hữu cơ được dùng để chạy sắc ký. Tiến hành sắc ký lớp

mỏng, thử triển khai với 4 hệ dung môi. Phát hiện vết bằng hiện hình VSV (Vi khuẩn sử

dụng là P. mirabilis). Thành phần các hệ dung môi và kết quả thử được thể hiện ở bảng

3.10.

Bảng 3.10: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký

Dung môi



Thành phần



Tỷ lệ



Rf



1



Chloroform: methanol: amoniac 25%



2: 2: 1



0,89



2



Butanol: ethanol: dimethylformamid



3: 1: 1



0,79



3



Butylacetat: aceton: triethylamin



1: 2: 1



0,84



4



Ethylacetat:propanol:dichloromethan



2: 2: 1



0,83



Nhận xét: Cả 4 hệ đều cho kết quả có vết kháng sinh. Hệ 3 có khả năng tách tốt

hơn cả vì vết hiện hình VSV có dạng vết kéo dài, trong khi với các hệ 1, 2, 4 vết gần như

hình tròn.

3.9. Kết quả sắc ký cột

Mục đích: Tinh chế, loại tạp nhằm thu lấy kháng sinh tinh khiết.

Dịch lọc của dịch lên men gộp lại được khoảng 5,5 lít, đem chiết bằng ethylacetat

ở pH 7 thu được 820 ml dung môi hữu cơ. Lượng dung môi này mang cất bằng máy cất

quay chân không Buchi Waterbath, thu được 0,7045g bột kháng sinh thô.

Cho lượng bột này chạy qua cột Silicagel với hệ dung môi 3. Lấy 30 phân đoạn,

mỗi phân đoạn 5ml vào ống nghiệm sạch. Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp

khoanh giấy lọc (VSV kiểm định P. mirabilis). Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng

3.11.

Bảng 3.11: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 (trên P.mirabilis)

Phân đoạn



D (mm)



s



Phân đoạn



D (mm)



s



1



0,00



0,00



12



10,05



0,21



2



24,45



0,36



13



10,03



0,33



3



24,17



0,19



14



9,53



0,23



35



4



23,37



0,34



15



9,51



0,22



5



22,75



0,43



16



9,16



0,18



6



22,33



0,24



17



8,66



0,34



7



21,14



0,18



18



8,27



0,19



8



19,49



0,31



19



8,23



0,20



9



17,23



0,34



20



8,12



0,14



10



16,25



0,24



21



7,83



0,14



11



10,21



0,12



22-30



0,00



0,00



Nhận xét: Có ít nhất 2 chất có HTKS trong bột kháng sinh thơ thu được. Có thể

phân đoạn kháng sinh chính là các phân đoạn từ 2-10. Gộp các phân đoạn lại đem cô

chân không, thu được: 0,5148g bột kháng sinh. Cho lượng bột này chạy qua cột Silicagel

với hệ dung môi ethylacetat: n-hexan: methanol (15:6:1). Lấy 30 phân đoạn, mỗi phân

đoạn 2ml vào ống nghiệm sạch. Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh

giấy lọc (trên P. mirabilis) và Rf mỗi phân đoạn. Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng

3.12.

Bảng 3.12: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 (trên P.mirabilis)

Phân



HTKS



Rf



đoạn



D (mm)



s



Vết 1



1



26,41



0,28



2



26,65



3



Phân



HTKS



Rf



đoạn



D (mm)



s



Vết 1



Vết 2



0,82



13



23,37



0,17



0,83



0,68



0,24



0,80



14



23,13



0,06



0,82



0,67



25,63



0,22



0,83



15



22,82



0,12



0,82



0,67



4



25,57



0,23



0,82



16



22,52



0,14



0,81



0,68



5



25,54



0,09



0,81



17



22,51



0,25



0,82



0,66



6



25,51



0,22



0,81



18



21,72



0,26



0,67



7



24,47



0,23



0,80



19



21,55



0,23



0,66



8



24,43



0,41



0,81



20



20,61



0,14



0,67



9



24,40



0,23



0,83



21



20,29



0,17



0,66



10



24,32



0,26



0,82



22



19,36



0,21



0,67



Vết 2



0,67



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

36



11



24,25



0,19



0,83



0,66



23



12



23,45



0,29



0,82



0,68



24-30



18,85



0,23



0,66

0,00



0,00



Nhận xét: Phân đoạn chính là phân đoạn từ 1-9, được gộp lại, đem cô chân không,

kết tinh được 0,1748 g KS1 tinh khiết. Phân đoạn từ 18-23 cũng được gộp lại, đem cô

chân không, kết tinh thu được 0,0529g KS2 tinh khiết. Như vậy hiệu suất tinh chế đạt

32,32%.

3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và biện giải phổ xác định sơ bộ các nhóm chức

đặc trưng của kháng sinh thu được

Nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh: 232,6ºC.

Phổ hấp thụ hồng ngoại, tử ngoại của kháng sinh sinh tổng hợp bởi Streptomyces

155.29 được giới thiệu ở phần phụ lục hình P6, P7.

Phổ tử ngoại (hình P6): Cho các đỉnh hấp thụ ở: 212nm, 239nm và 442 nm. Từ

đó, dự đốn cấu trúc KS có nhân thơm, nối đơi liên hợp, dị tố O, N, halogen…, hoặc kết

hợp các đặc điểm trên.

Phổ hồng ngoại (hình P7): Dựa vào các đỉnh hấp thụ trên phổ IR có thể dự đốn

trong cấu trúc phân tử kháng sinh có các nhóm chức amino, hydroxyl, carbonyl, amid,

nitro, imin… Các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đốn tương ứng

được trình bày trong bảng 3.13.

Bảng 3.13: Phổ IR

λ (cm-1)



Nhóm chức đặc trưng



3442



Đặc trưng cho nhóm chức Amin bậc 2



3057



Đặc trưng cho cấu trúc alken và vòng thơm



2964, 2928



Đặc trưng cho nhóm chức alcol và phenol



1745



Chứa gốc acid carboxylic, ester



1646



Đặc trưng cho cấu trúc alken



1300,1270,



Đặc trưng cho các nhóm chức alcol, ether, acid carboxylic,ester



1194, 1097

Phổ khối (hình P8 ): Khối lượng phân tử dự kiến của kháng sinh thu được là

1280,1 đvC.



37



KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tơi đã cơ bản hồn thành được mục tiêu ban đầu

của khóa luận tốt nghiệp. Các kết luận cụ thể như sau:

• Qua 2 lần đột biến bằng UV và 1 lần đột biến hóa học thì hoạt tính kháng sinh của

Streptomyces 155.29 tăng lên đáng kể.

• Tìm được MT nuôi cấy bề mặt tốt nhất là MT2 và MT lên men chìm tốt nhất với

chủng Streptomyces 155.29 là MT2dt.

Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi ethylacetat ở pH 7 cho hiệu quả

tốt nhất.

• Kháng sinh do Streptomyces 155.29 sinh tổng hợp có một số đặc điểm như sau:

-



Là kháng sinh có phổ tác dụng rộng, trên cả vi khuẩn Gram(+) và vi khuẩn

Gram(-),



-



Tương đối bền với nhiệt độ,



-



Bền với pH acid và trung tính, ít bền với pH base,



-



Có ít nhất 2 thành phần hoạt động trong kháng sinh thô thu được,



-



Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt khoảng 32,32%



-



Kháng sinh tinh khiết có nhiệt độ nóng chảy 232,6ºC, hấp thụ ánh sáng tử

ngoại, hồng ngoại. Cấu trúc phân tử kháng sinh được dự đốn có thể chứa

nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố; các nhóm chức có trong kháng sinh là:

ester, alkyl clorid, alkyl flourid, imin, amin, nitro, amid.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

38



KIẾN NGHỊ

Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu

sâu hơn theo các hướng sau:

• Tiến hành giải trình tự gen để xác định chính xác tên khoa học của Streptomyces

155.29.

• Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 155.29 (bằng UV, bằng hóa chất, phương pháp

đột biến bậc thang,…) để tạo ra chủng có khả năng siêu sinh tổng hợp kháng sinh.

• Khảo sát tìm điều kiện lên men tốt nhất để nâng cao hiệu suất tinh chế và tạo kháng

sinh tinh khiết.

• Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách để tạo ra kháng sinh với độ tinh khiết và hiệu

suất cao hơn. Chiết tách để thu lấy các kháng sinh phụ và nghiên cứu sâu hơn.

• Tiến hành cộng hưởng từ hạt nhân, xác định các tính chất lý, hóa,… để xác định

chính xác cấu trúc hóa học của kháng sinh do Streptomyces 155.29 sinh tổng hợp.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Trần Tử An (2002), Phương pháp chiết ứng dụng trong kiểm nghiệm và độc chất,

Trung tâm Thông tin- Thư viện ĐH Dược, Hà Nội, tr. 40-41, 49-59.

2. Kiều Hữu Ảnh (1999), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học kỹ

thuật, Hà Nội, tr. 167-172.

3. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản

Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr. 11-16.

4. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật Y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 15-16,

50-56.

5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học,

Nhà xuất bản Giáo dục, tr. 38-67.

6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo (2006), Các nhóm vi khuẩn chủ yếuPhân loại xạ khuẩn

http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm.

7. Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng

sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên, Luận văn thạc sỹ Sinh học,

trường Đại học Sư Phạm, Thái Nguyên, tr.3-16.

8. Từ Minh Kng (2004), Cơ sở cơng nghệ sinh học và sản xuất dược phẩm, Nhà

xuất bản Y học, Hà Nội, tr.42-54.

9. Đoàn Thị Nguyện (2009), Vi sinh vật, NXB Giáo dục Việt Nam, tr. 7-37.

10. Lương Đức Phẩm (1999), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp.

11. Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách, phân chia, xác định các chất bằng dung môi hữu

cơ, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập 1, tr.9-27.

12. Nguyễn Văn Thạch (2009), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục Việt Nam,

tr. 35-37.

13. Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, tr.40-52.

14. Nguyễn Văn Thanh (2009), Công nghệ sinh học dược, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà

Nội, tr. 14-57.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi



15. Trịnh Thị Thịnh (2009), Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces

80.259, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường ĐH Dược Hà Nội, Hà Nội.

16. Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, NXB Y học, tập 2..

17. Bộ mơn Hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà

Nội, tr. 23-69, 125-147, 215-219, 318.

18. Bộ Y tế (2007), Dược lý học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2, tr. 130-142.

19. Bộ Y tế (2007), Hóa hữu cơ, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2, tr.105-119.

20. Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 68-82,

115-133.

21. Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2,

tr.26-40, 81-93.

22. Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội, tr. 22-98.



Tiếng Anh

23. Barun K. Bhattacharyya, Sushil C. Pal, Sukanta K. Sen (1998), “Antibiotic

production by Streptomyces hygroscopius D1.5: cultural efect”, Revista de

Microbiologia, 29 (3), pp.37-39.

24. Liu G, Chater KF, Chandra G, Niu G, Tan H (2013), Molecular regulation of

antibiotic biosynthesis in streptomyces, State Key Laboratoryof Microbial

Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing,

China.

25. Alam M, Dharni S, Abdul-Khaliq, Srivastava SK, Samad A, Gupta MK (2012), A

promising strain of Streptomyces sp. with agricultural traits for growth promotion

and disease management, Department of Plant Pathology, CSIR-Central Institute

of Medicinal & Aromatic Plants (CIMAP), Lucknow 226 015, India.



PHỤ LỤC



Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch



Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi



Hình P3: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc



Hình P4: Phát hiện vết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV



Hình P5: Tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi



Hình P6: Phổ tử ngoại của kháng sinh



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Nhận xét: Chủng streptomyces 155.29 khá bền với nhiệt độ, hoạt tính kháng sinh hầu như không thay đổi.

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×