Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

Tải bản đầy đủ - 0trang

Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

28



Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1

Hoạt tính kháng sinh

Kí hiệu



P.mirabilis



dạng

biến chủng



S.aureus

% hoạt tính



D (mm)



s



so với mẫu



% hoạt tính

D (mm)



s



chứng



so với mẫu

chứng



ĐB1.6



22,08



0,52



115,00



22,10



0,70



117,62



ĐB1.8



22,65



0,61



117,99



24,07



0,24



128,12



ĐB1.13



20,27



0,28



105,59



16,73



0,84



89,02



ĐB1.14



23,40



0,56



121,88



24,29



0,54



129,29



ĐB1.21



21,83



0,33



113,72



17,86



0,48



95,05



ĐB1.23



24,12



0,37



125,63



23,49



0,44



125,03



ĐB1.24



21,33



0,43



111,11



20,65



0,31



109,92



ĐB1.26



21,75



0,23



113,30



21,67



0,29



115,31



ĐB1.27



20,35



0,24



105,97



19,14



0,47



101,86



ĐB1.28



21,40



0,74



111,46



19,99



0,46



106,37



Mẫu chứng



19,20



0,51



100,00



18,79



0,55



100,00



Nhận xét: Chọn 3 biến chủng số 8, 14, 23 (ĐB1.08, ĐB1.14, ĐB1.23) để nhân

giống, lưu trữ và bảo quản cho các nghiên cứu về sau.

3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2

Tiếp tục đem chủng ĐB1.23 bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách chiếu 60

cm, thời gian 5 phút, tỷ lệ sống sót là 0,23%. Thử HTKS 33 biến chủng sau đột biến bằng

phương pháp khối thạch. Kết quả chính được trình bày ở bảng 3.3.



29



Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2

Hoạt tính kháng sinh

Kí hiệu



P.mirabilis



dạng

biến chủng



S.aureus

% hoạt tính



D (mm)



s



so với mẫu



% hoạt tính

D (mm)



s



chứng



so với mẫu

chứng



ĐB2.05



23,95



0,59



105,08



22,15



0,58



104,50



ĐB2.06



24,35



0,68



106,86



21,19



0,87



99,94



ĐB2.13



26,03



0,39



114,20



24,67



0,31



116,38



ĐB2.17



24,25



0,36



106,42



22,23



0,81



104,84



ĐB2.19



26,08



0,14



114,44



24,71



0,66



116,57



ĐB2.22



22,37



0,81



98,14



20,27



0,40



95,60



ĐB2.25



23,71



0,29



104,02



21,17



0,45



99,84



ĐB2.26



26,62



0,47



116,81



23,81



0,48



112,30



ĐB2.27



23,73



0,31



104,11



21,69



0,61



102,30



ĐB2.28



25,56



0,57



112,15



21,01



0,33



99,09



Mẫu chứng



22,79



0,51



100,00



21,20



0,16



100,00



Nhận xét: Chọn 3 biến chủng số 13, 19, 26 (ĐB2.13, ĐB2.19, ĐB2.26) để nhân

giống, lưu trữ và bảo quản cho các nghiên cứu về sau.

3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống bằng phương pháp hóa học

Tiếp tục đem chủng ĐB2.26 đột biến bằng phương pháp hóa học. Thử HTKS 33

biến chủng sau đột biến bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính được trình bày ở

bảng 3.4.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

30



Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học

Hoạt tính kháng sinh

P.mirabilis



Kí hiệu



% hoạt



dạng

biến chủng



S.aureus



D (mm)



s



tính so với

mẫu



% hoạt

D (mm)



s



chứng



tính so với

mẫu

chứng



ĐBHH.04



25,99



0,45



104,03



24,99



0,27



106,28



ĐBHH.05



27,15



0,27



108,67



25,78



0,39



109,66



ĐBHH.10



27,15



0,38



108,70



25,58



0,61



108,80



ĐBHH.15



25,71



0,34



102,91



25,53



0,51



108,61



ĐBHH.19



27,65



0,38



110,70



25,47



0,43



108,32



ĐBHH.20



26,11



0,18



104,54



24,55



0,23



104,44



ĐBHH.24



25,83



0,34



103,42



24,08



0,68



102,42



ĐBHH.26



26,25



0,44



105,07



23,91



0,72



101,72



ĐBHH.28



25,51



0,33



102,14



24,54



0,30



104,38



ĐBHH.32



26,25



0,42



105,10



22,89



0,33



98,38



Mẫu chứng



24,98



0,18



100,00



23,51



0,23



100,00



Nhận xét: Chọn 3 biến chủng số 5, 10, 19 (ĐBHH.5, ĐBHH.10, ĐBHH.19) để

nhân giống, lưu trữ và bảo quản cho các nghiên cứu về sau.

3.5. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh

3.5.1. Kết quả chọn môi trường lên men chìm

Với mục đich chọn mơi trường để Streptomyces 155.29 sinh kháng sinh tốt nhất.

Thực hiện lên men chìm streptomyces 155.29 trên 3 môi trường dinh dưỡng MT1dt,

MT2dt, MT3dt. Lọc dịch lên men qua giấy lọc để bỏ sinh khối. Thử hoạt tính kháng sinh

bằng phương pháp giếng thạch. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5.



31



Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men (trên P.mirabilis)

VSV kiểm định



MT1dt



MT2dt



MT3dt



D (mm)



s



D (mm)



s



D (mm)



s



P.mirabilis



20,51



0,46



22,61



0,53



19,75



0,32



S.aureus



17,77



0,28



20,64



0,27



19,63



0,39



Nhận xét: chọn MT2dt là môi trường lên men chìm hiệu quả nhất.

3.5.2. Kết quả chọn chủng lên men

Từ các thí nghiệm sàng lọc ngẫu nhiên, đột biến lần 1, lần 2, đột biến hóa học, đã

chọn lựa và lưu giữ được 12 dạng chủng và biến chủng của Streptomyces 155.29. Thực

hiện lên men chìm riêng rẽ các biến chủng này trong MT2dt. Dịch lên men được lọc qua

giấy lọc để loại sinh khối rồi thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch. Kết quả được

trình bày ở bảng 3.6.

Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men chìm

Hoạt tính kháng sinh

Dạng chủng



P.mirabilis



Biến chủng



S.aureus



D (mm)



s



D (mm)



s



SLNN.1



23,01



0,16



21,57



0,55



SLNN.4



24,54



0,43



22,58



0,45



SLNN.7



24,25



0,19



22,95



0,42



ĐB1.8



25,51



0,57



23,49



0.29



ĐB1.14



23,40



0,41



22,72



0,98



ĐB1.23



24,98



0,31



23,29



0,27



ĐB2.13



26,63



0,48



24,41



0,36



ĐB2.19



24,84



0,69



23,51



0,35



ĐB2.26



27,49



0,41



25,87



0,13



ĐBHH.5



25,43



0,38



23,61



0,46



ĐBHH.10



26,09



0,22



25,51



0,44



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

32



ĐBHH.19



25,14



1,43



24,73



0,92



Nhận xét: Biến chủng ĐB2.26 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất,

chọn làm chủng lên men chìm lấy dịch cho những nghiên cứu lên men tổng hợp kháng

sinh sau.

3.6. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh

trong dịch lọc

Dịch lọc được thử độ bền pH (ở các pH 3, 5, 7, 9, 11) và độ bền nhiệt (đun sôi

cách thủy 30 phút, trực tiếp 10 phút). Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7 và 3.8.

* Ảnh hưởng của pH: Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh (trên P.mirabilis)

HTKS sau 1 ngày



HTKS sau 5 ngày



P.mirabilis



P.mirabilis



Mẫu thử



D (mm)



s



D (mm)



s



pH 3



21,36



0,31



21,29



0,28



pH 5



21,44



0,31



21,45



0,33



pH 7



21,74



0,25



21,60



0,11



pH 9



21,31



0,19



21,20



0,14



pH 11



20,69



0,34



19,64



0,09



Nhận xét: Chủng Streptomyces 155.29 khá bền với pH từ acid đến trung tính, ít

bền với pH base. Do đó bảo quản dịch lọc ở pH acid hoặc trung tính.

* Ảnh hưởng của độ bền nhiệt: Kết quả được thể hiện ở bảng 3.8.

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền kháng sinh (trên P.mirabilis)

P.mirabilis

Thử nghiệm



D (mm)



s



Dịch lọc ở nhiệt độ thường



21.35



0.28



Dịch lọc đun sôi trực tiếp (10 phút)



21.52



0.18



Dịch lọc đun cách thủy ( 30 phút)



21.18



0.18



33



Nhận xét: Chủng streptomyces 155.29 khá bền với nhiệt độ, hoạt tính kháng sinh hầu như

khơng thay đổi.

3.7. Kết quả chọn dung môi và pH chiết

Thực hiện chiết dịch lọc với 4 dung môi: ethylacetat, butanol, butylacetat,

dichloromethan ở 5 pH 3, 5, 7, 9, 11. Thử HTKS của pha nước và pha dung môi bằng

phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày cụ thể ở bảng 3.9.

Bảng 3.9: Kết quả chọn dung môi và pH chiết (trên P.mirabilis )



pH



Pha



Ethylacetat



n-Butanol



Butylacetat



Chloroform



D



D



D



D



(mm)

3



5



7



9



11



s



(mm)



s



(mm)



s



(mm)



s



Dung môi



21,28



0,23



21,54



0,31



16,55



0,17



17,61



0,23



Nước



0,00



0,00



0,00



0,00



14,47



0,19



15,59



0,18



Dung môi



21,67



0,17



21,67



0,25



17,23



0,18



17,53



0,26



Nước



0,00



0,00



0,00



0,00



13,75



0,12



15,61



0,19



Dung môi



21,89



0,14



21,66



0,18



17,36



0,11



16,43



0,08



Nước



0,00



0,00



0,00



0,00



13,95



0,43



14,53



0,41



Dung môi



21,33



0,15



21,56



0,20



15,50



0,20



16,67



0,33



Nước



0,00



0,00



0,00



0,00



14,57



0,42



15,00



0,19



Dung môi



16,62



0,28



16,83



0,17



15,15



0,12



15,29



0,28



Nước



0,00



0,00



0,00



0,00



14,58



0,18



14,49



0,23



Nhận xét: Dung môi Buthylacetat và Chloroform đều không chiết kiệt được kháng

sinh trong dịch lọc. Dung môi ethylacetal và n-butanol đều chiết kiệt kháng sinh trong

dịch lọc ở các pH khác nhau, HTKS cũng tương đương nhau nhưng lựa chọn ethylacetat

bởi vì khi chiết bằng n-butanol tạo rất nhiều nhũ tương, làm giảm hiệu suất chiết đáng kể.

Ngồi ra, n-butanol là dung mơi độc hơn so với ethylacetat.

HTKS khi chiết ở pH 7 có giá trị cao nhất.

Vậy chọn dung mơi ethylacetat để chiết và chiết ở pH 7.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

34



3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi

Dịch chiết dung môi hữu cơ được dùng để chạy sắc ký. Tiến hành sắc ký lớp

mỏng, thử triển khai với 4 hệ dung môi. Phát hiện vết bằng hiện hình VSV (Vi khuẩn sử

dụng là P. mirabilis). Thành phần các hệ dung môi và kết quả thử được thể hiện ở bảng

3.10.

Bảng 3.10: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký

Dung môi



Thành phần



Tỷ lệ



Rf



1



Chloroform: methanol: amoniac 25%



2: 2: 1



0,89



2



Butanol: ethanol: dimethylformamid



3: 1: 1



0,79



3



Butylacetat: aceton: triethylamin



1: 2: 1



0,84



4



Ethylacetat:propanol:dichloromethan



2: 2: 1



0,83



Nhận xét: Cả 4 hệ đều cho kết quả có vết kháng sinh. Hệ 3 có khả năng tách tốt

hơn cả vì vết hiện hình VSV có dạng vết kéo dài, trong khi với các hệ 1, 2, 4 vết gần như

hình tròn.

3.9. Kết quả sắc ký cột

Mục đích: Tinh chế, loại tạp nhằm thu lấy kháng sinh tinh khiết.

Dịch lọc của dịch lên men gộp lại được khoảng 5,5 lít, đem chiết bằng ethylacetat

ở pH 7 thu được 820 ml dung môi hữu cơ. Lượng dung môi này mang cất bằng máy cất

quay chân không Buchi Waterbath, thu được 0,7045g bột kháng sinh thô.

Cho lượng bột này chạy qua cột Silicagel với hệ dung môi 3. Lấy 30 phân đoạn,

mỗi phân đoạn 5ml vào ống nghiệm sạch. Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp

khoanh giấy lọc (VSV kiểm định P. mirabilis). Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng

3.11.

Bảng 3.11: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 (trên P.mirabilis)

Phân đoạn



D (mm)



s



Phân đoạn



D (mm)



s



1



0,00



0,00



12



10,05



0,21



2



24,45



0,36



13



10,03



0,33



3



24,17



0,19



14



9,53



0,23



35



4



23,37



0,34



15



9,51



0,22



5



22,75



0,43



16



9,16



0,18



6



22,33



0,24



17



8,66



0,34



7



21,14



0,18



18



8,27



0,19



8



19,49



0,31



19



8,23



0,20



9



17,23



0,34



20



8,12



0,14



10



16,25



0,24



21



7,83



0,14



11



10,21



0,12



22-30



0,00



0,00



Nhận xét: Có ít nhất 2 chất có HTKS trong bột kháng sinh thơ thu được. Có thể

phân đoạn kháng sinh chính là các phân đoạn từ 2-10. Gộp các phân đoạn lại đem cô

chân không, thu được: 0,5148g bột kháng sinh. Cho lượng bột này chạy qua cột Silicagel

với hệ dung môi ethylacetat: n-hexan: methanol (15:6:1). Lấy 30 phân đoạn, mỗi phân

đoạn 2ml vào ống nghiệm sạch. Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh

giấy lọc (trên P. mirabilis) và Rf mỗi phân đoạn. Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng

3.12.

Bảng 3.12: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 (trên P.mirabilis)

Phân



HTKS



Rf



đoạn



D (mm)



s



Vết 1



1



26,41



0,28



2



26,65



3



Phân



HTKS



Rf



đoạn



D (mm)



s



Vết 1



Vết 2



0,82



13



23,37



0,17



0,83



0,68



0,24



0,80



14



23,13



0,06



0,82



0,67



25,63



0,22



0,83



15



22,82



0,12



0,82



0,67



4



25,57



0,23



0,82



16



22,52



0,14



0,81



0,68



5



25,54



0,09



0,81



17



22,51



0,25



0,82



0,66



6



25,51



0,22



0,81



18



21,72



0,26



0,67



7



24,47



0,23



0,80



19



21,55



0,23



0,66



8



24,43



0,41



0,81



20



20,61



0,14



0,67



9



24,40



0,23



0,83



21



20,29



0,17



0,66



10



24,32



0,26



0,82



22



19,36



0,21



0,67



Vết 2



0,67



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

36



11



24,25



0,19



0,83



0,66



23



12



23,45



0,29



0,82



0,68



24-30



18,85



0,23



0,66

0,00



0,00



Nhận xét: Phân đoạn chính là phân đoạn từ 1-9, được gộp lại, đem cô chân không,

kết tinh được 0,1748 g KS1 tinh khiết. Phân đoạn từ 18-23 cũng được gộp lại, đem cô

chân không, kết tinh thu được 0,0529g KS2 tinh khiết. Như vậy hiệu suất tinh chế đạt

32,32%.

3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và biện giải phổ xác định sơ bộ các nhóm chức

đặc trưng của kháng sinh thu được

Nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh: 232,6ºC.

Phổ hấp thụ hồng ngoại, tử ngoại của kháng sinh sinh tổng hợp bởi Streptomyces

155.29 được giới thiệu ở phần phụ lục hình P6, P7.

Phổ tử ngoại (hình P6): Cho các đỉnh hấp thụ ở: 212nm, 239nm và 442 nm. Từ

đó, dự đốn cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố O, N, halogen…, hoặc kết

hợp các đặc điểm trên.

Phổ hồng ngoại (hình P7): Dựa vào các đỉnh hấp thụ trên phổ IR có thể dự đốn

trong cấu trúc phân tử kháng sinh có các nhóm chức amino, hydroxyl, carbonyl, amid,

nitro, imin… Các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đốn tương ứng

được trình bày trong bảng 3.13.

Bảng 3.13: Phổ IR

λ (cm-1)



Nhóm chức đặc trưng



3442



Đặc trưng cho nhóm chức Amin bậc 2



3057



Đặc trưng cho cấu trúc alken và vòng thơm



2964, 2928



Đặc trưng cho nhóm chức alcol và phenol



1745



Chứa gốc acid carboxylic, ester



1646



Đặc trưng cho cấu trúc alken



1300,1270,



Đặc trưng cho các nhóm chức alcol, ether, acid carboxylic,ester



1194, 1097

Phổ khối (hình P8 ): Khối lượng phân tử dự kiến của kháng sinh thu được là

1280,1 đvC.



37



KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tơi đã cơ bản hồn thành được mục tiêu ban đầu

của khóa luận tốt nghiệp. Các kết luận cụ thể như sau:

• Qua 2 lần đột biến bằng UV và 1 lần đột biến hóa học thì hoạt tính kháng sinh của

Streptomyces 155.29 tăng lên đáng kể.

• Tìm được MT ni cấy bề mặt tốt nhất là MT2 và MT lên men chìm tốt nhất với

chủng Streptomyces 155.29 là MT2dt.

Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi ethylacetat ở pH 7 cho hiệu quả

tốt nhất.

• Kháng sinh do Streptomyces 155.29 sinh tổng hợp có một số đặc điểm như sau:

-



Là kháng sinh có phổ tác dụng rộng, trên cả vi khuẩn Gram(+) và vi khuẩn

Gram(-),



-



Tương đối bền với nhiệt độ,



-



Bền với pH acid và trung tính, ít bền với pH base,



-



Có ít nhất 2 thành phần hoạt động trong kháng sinh thô thu được,



-



Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt khoảng 32,32%



-



Kháng sinh tinh khiết có nhiệt độ nóng chảy 232,6ºC, hấp thụ ánh sáng tử

ngoại, hồng ngoại. Cấu trúc phân tử kháng sinh được dự đốn có thể chứa

nhân thơm, nối đơi liên hợp, dị tố; các nhóm chức có trong kháng sinh là:

ester, alkyl clorid, alkyl flourid, imin, amin, nitro, amid.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

38



KIẾN NGHỊ

Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu

sâu hơn theo các hướng sau:

• Tiến hành giải trình tự gen để xác định chính xác tên khoa học của Streptomyces

155.29.

• Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 155.29 (bằng UV, bằng hóa chất, phương pháp

đột biến bậc thang,…) để tạo ra chủng có khả năng siêu sinh tổng hợp kháng sinh.

• Khảo sát tìm điều kiện lên men tốt nhất để nâng cao hiệu suất tinh chế và tạo kháng

sinh tinh khiết.

• Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách để tạo ra kháng sinh với độ tinh khiết và hiệu

suất cao hơn. Chiết tách để thu lấy các kháng sinh phụ và nghiên cứu sâu hơn.

• Tiến hành cộng hưởng từ hạt nhân, xác định các tính chất lý, hóa,… để xác định

chính xác cấu trúc hóa học của kháng sinh do Streptomyces 155.29 sinh tổng hợp.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×