Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích

Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích

Tải bản đầy đủ - 0trang

Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

20



• Tìm hệ dung mơi khai triển có khả nãng tách hỗn hợp kháng sinh tối thích.

• Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ.

2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được

• Xác định nhiệt độ nóng chảy

• Đo phổ IR, phổ UV, phổ khối.

2.3. Phương pháp thực nghiệm

2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

• Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT ni cấy thích hợp, ủ

cho phát triển ở 28-29°C.

• Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản

ở 2°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền.

2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

• Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định,

kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV

kiểm định tạo thành vòng vơ khuẩn.

• Tiến hành:

-



Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2.5 ml

MT canh thang, ủ ở 37°C trong 16-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn

dịch VSV có nồng độ 106-108 tế bào/ml.



-



Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội

đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa

Petri vơ trùng với thể tích 20ml/đĩa.



-



Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:

Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã

được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ

dưới 50C, sau đó đặt lên bề mặt mơi trường đã cấy VSV kiểm định. (Xem

hình P3 ở phụ lục).

Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV

sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định. (Xem hình P1).



21



Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên

MT đã cấy VSV kiểm định. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng. (Xem

hình P2).

-



Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với

vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV

kiểm định.



-



Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vơ khuẩn bằng thước kẹp Palmer có

độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vơ

khuẩn xử lý theo cơng thức:

n



n



Di

( Di − D) 2





=i 1 =i 1

=

D =

s

n

n −1



Trong đó:

D (mm): Đường kính trung bình vòng vơ khuẩn,

Di (mm): Đường kính vòng vơ khuẩn thứ i,



s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,

n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thơng thường n=3).

2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên

• Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 155.29, cho vào

ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn

dịch bào tử ở độ pha lỗng 10-1 (định ước). Sau đó, pha lỗng tương tự đến nồng

độ 10-6 bằng nước vơ trùng.

• Cấy bào tử: Dùng pipet vơ trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha

loãng 10-4, 10-5, 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT2 trong đĩa Petri. Dùng que

trang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử lên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa Petri

cho mỗi nồng độ pha loãng. Cho các đĩa vào tủ ấm 28°C trong 6 ngày cho xuất

hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.

• Sàng lọc ngẫu nhiên: Chọn các khuẩn lạc phát triển đặc thù, mọc riêng rẽ sau 6

ngày rồi lấy ra cấy thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

22



2.3.4. Đột biến

• Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 155.29, cho vào

ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được

hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó dung 1ml hỗn dịch bào tử

này pha loãng đến nồng độ 10-6 làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa

Petri vơ trùng.

• Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-1

đựng trong đĩa Petri được chiếu ánh sáng UV (λ=254nm) với khoảng cách và thời

gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian 5 phút), sau đó lấy ra, để chỗ tối 2h,

rồi dùng pipet vơ trùng pha lỗng đến nồng độ 10-5 bằng nước cất vơ trùng.

• Bằng tác nhân hố học acid nitrơ (HNO2):

Nguyên tắc: HCl + NaNO2 = NaCl + HNO2

Pha hỗn dịch bào tử : Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 155.29 cho

vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng , lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử

có độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó lấy 1ml pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6

bằng nước vô trùng.

Hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử độ pha loãng



10-6, nhỏ vào hộp Petri có môi



trường thạch, dàn đều bằng que chang vô trùng, để vào tủ ấm làm mẫu chứng.

Đột biến bằng acid ni trơ: 9 ml còn lại trong ống nồng độ



10-1 cho thêm



0,07g NaNO2. Điều chỉnh pH xuống 4-4,5 bằng dung dịch HCl 0,1N, để yên trong

2-3 phút. Sau đó điều chỉnh pH lên 7-8 bằng dung dịch NaOH 0,1N , rồi dùng

pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5.

Phân tán bào tử sau đột biến , tính tốn kết quả, chọn lọc ngẫu nhiên các

biến chủng thực hiện như đột biến bằng ánh sáng UV.

• Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vơ trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng

10-6 và 0,1ml hỗn dịch đã đột biến ở các nồng độ 10-4 và 10-5 vào các đĩa Petri có

chứa MT2, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề

mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song. Các đĩa Petri sau khi cấy được ủ



23



ở nhiệt độ 28°C trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc, xác

định % độ sống sót theo cơng thức:

% đợ sớng sót =



Nm

x 10-6+k x 100%

N0



Trong đó: Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến,

No: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng,

10-k: Nồng độ hỗn dịch bào tử.

• Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như phương pháp

chọn lọc ngẫu nhiên. Làm song song mẫu chứng. Phần trăm biến đổi hoạt tính

được xác định theo cơng thức:

% biến đổi hoạt tính =



Di

×100%

Do



Trong đó:

D i : Đường kính trung bình vòng vơ khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến,

D o : Đường kính trung bình vòng vơ khuẩn của mẫu chứng.



• Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến

chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh

• Ngun tắc: Sau khi có kết quả xác định được các môi trường nuôi cấy bề

mặt tối thích cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián

đoạn trong các mơi trường lỏng tương ứng.

• Tiến hành

-



Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 155.29 sau khi nuôi cấy trên

thạch nghiêng (MT2) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml

chứa 100ml MT2dt bằng 10ml nước cất vơ trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt

độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.



-



Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên một số MT khác nhau để

chọn MT lên men tốt nhất. Giống cấp 1 được cấy vơ trùng sang bình nón

500ml chứa các MT dinh dưỡng với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10. Các bình lên



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

24



men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h.

Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống

cấp 1 trên MT2dt được lên men trên môi trường tối ưu cho việc sinh tổng hợp

kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất.

2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men

• Mục đích: Xác định khả năng chịu nhiệt của kháng sinh và mức độ ảnh hưởng của

các pH khác nhau lên độ bền vững của kháng sinh. Từ đó có những chú ý trong

quá trình làm thực nghiệm, bảo quản, xử lý và tinh chế kháng sinh.

• Tiến hành:

-



Thử độ bền nhiệt: Dịch lọc được phân vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 7ml.

Một ống được đun sôi trực tiếp 10 phút, một ống được đun sôi cách thủy 30

phút, một ống để ở nhiệt độ bình thường. Sau khi ba ống trở về nhiệt độ bình

thường, đem thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch.



-



Thử độ bền pH: Dịch lọc được cho vào 5 ống nghiệm (làm 3 dãy song song),

mỗi ống khoảng 7ml. Điều chỉnh pH trong các ống lần lượt là 3, 5, 7, 9, 11,

bảo quản trong tủ lạnh. Sau 1 ngày và 5 ngày, chỉnh pH mỗi ống về pH trung

tính, thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch. Theo dõi sự thay đổi HTKS.



2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung mơi hữu cơ

• Mục đích: Xác định dung mơi và pH chiết tối thích cho dịch lọc.

• Tiến hành: Dùng phương pháp chiết 1 lần.

-



Dịch lọc được chỉnh về các pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 1M và

HCl 1M.



-



Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với một số dung môi khác nhau: Dịch lọc và

dung mơi cho vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung mơi:Vdịch lọc = 1:5. Sau đó lắc kỹ

trong 1 phút. Để yên 1h cho phân lớp. Tách riêng lấy lớp dung môi và dịch

lọc.



-



Sau mỗi lần chiết, lấy lớp dung môi và lớp dịch lọc thử hoạt tính kháng

sinh theo phương pháp khoanh giấy.



25



2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng

• Mục đích: Xác định các thành phần kháng sinh trong dịch lọc hoặc xác định

kháng sinh đã tinh khiết hay chưa.

• Tiến hành:

-



Cắt bản mỏng có kích thước thích hợp, hoạt hóa ở 110°C/30 phút.



-



Pha hỗn hợp dung mơi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký (lớp dung mơi

khơng q 1cm), để n bình khoảng 1h để bão hòa dung mơi.



-



Dùng ống mao quản đường kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc ký lên bản

mỏng. Chấm nhiều lần, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 50°C.



-



Đặt bản mỏng vào bình sắc ký. Cho dung mơi chạy lên khoảng ¾ chiều dài

bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy.



-



Xác định vết theo các phương pháp sau:

Soi đèn tử ngoại: Đặt bản mỏng sắc ký vào đèn tử ngoại, vết chất thử sẽ

hiện màu.

Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt trùng, đổ

một lớp vừa phải MT thạch thường đã cấy VSV kiểm định sao cho bản

mỏng chìm trong thạch. Để vào tủ 37°C, ủ trong 18-24h, vòng vơ khuẩn

xuất hiện nếu có kháng sinh. (Xem hình P6 ở phụ lục)

Phương pháp hiện màu hóa học: Bản mỏng được phun thuốc thử hiện màu,

sấy ở 70°C trong 10’ để phát hiện vết. Dùng thuốc thử ninhydrin 1% trong

cồn để phát hiện các kháng sinh có chứa nhóm amin.



-



Tính hệ số Rf (Retardation factor)

Rf =



Trong đó:



a

b



a: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết họat chất,

b: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

26



2.3.9. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay

Pha dung môi hữu cơ thu được sau khi chiết được cất bằng máy cất quay chân

khơng. Cắn thu được được hòa tan bằng một lượng nhỏ methanol, đổ vào bình nón sạch,

sấy ở 50°C đến khô. Cạo, thu lấy bột kháng sinh thô.

2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột

• Pha hệ dung mơi chạy theo đúng tỷ lệ, để 30 phút cho bão hòa.

• Chuẩn bị cột sắc ký: Cột có đường kính 1cm, dài 50cm được rửa sạch, tráng cồn,

sấy khô. Cân khoảng 8g hạt Silicagel nhồi cột, hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút,

đem hòa thành hỗn dịch với dung mơi chạy và đưa lên cột.

• Đưa mẫu thử lên cột: Bột kháng sinh thơ hòa tan trong một lượng tối thiểu

methanol rồi trộn với khoảng 2g Silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50°C cho bay hết

methanol rồi cho lên cột, ổn định cột trong 30 phút.

• Cho dung mơi chạy qua cột với tốc độ 0,5ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống

nghiệm sạch, khoảng 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml.

• Phát hiện và xác định các phân đoạn chứa kháng sinh cần tách: Thử HTKS của

các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS được

tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất. Các phân đoạn chính là

các phân đoạn từ khi xuất hiện vết đến khi khơng còn vết có Rf tương đương và

vẫn có hoạt tính kháng sinh mạnh.

• Các phân đoạn chính sau khi chạy cột được gộp vào bình cầu, cất quay chân

không. Cạo thu bột tinh thể kháng sinh vào ống nghiệm sạch. Sau đó, bột tinh thể

kháng sinh được kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi, lọc, sấy khô ở 50°C để thu

kháng sinh tinh khiết.

2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được

Kháng sinh tinh khiết được đo các thơng số: Nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại,

tử ngoại, phổ khối để bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đốn nhóm cấu

trúc kháng sinh thu được.



27



CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên

Tính kháng sinh của 33 dạng chủng (để phù hợp với quy luật số lớn) sau khi sàng lọc

ngẫu nhiên bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên

Dạng chủng



P.mirabilis



S.aureus



D (mm)



s



D (mm)



s



SLNN.1



22,73



0,21



20,23



0,08



SLNN.2



22,12



0,24



18,24



0,21



SLNN.4



22,38



0,13



19,11



0,30



SLNN.5



21,07



0,35



17,99



0,57



SLNN.7



22,21



0,30



21,31



0,34



SLNN.11



21,50



0,73



16,83



0,46



SLNN.15



20,46



0,20



17,89



0,46



SLNN.18



20,79



0,30



17,53



0,74



SLNN.24



20,19



0,59



18,99



0,42



SLNN.30



20,81



0,23



17,68



0,74



Nhận xét: Chọn 3 dạng chủng số 1, 4, 7 (SLNN.1, SLNN.4,SLNN.7) đem nhân

giống, bảo quản và sử dụng cho các nghiên cứu về sau.

3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1

Đem đột biến chủng SLNN.1 đột biến bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng

cách chiếu 60 cm, thời gian 5 phút, tỷ lệ sống sót là 0,31%. Thử HTKS 33 biến chủng

sau đột biến bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính được trình bày ở bảng 3.2.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

28



Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1

Hoạt tính kháng sinh

Kí hiệu



P.mirabilis



dạng

biến chủng



S.aureus

% hoạt tính



D (mm)



s



so với mẫu



% hoạt tính

D (mm)



s



chứng



so với mẫu

chứng



ĐB1.6



22,08



0,52



115,00



22,10



0,70



117,62



ĐB1.8



22,65



0,61



117,99



24,07



0,24



128,12



ĐB1.13



20,27



0,28



105,59



16,73



0,84



89,02



ĐB1.14



23,40



0,56



121,88



24,29



0,54



129,29



ĐB1.21



21,83



0,33



113,72



17,86



0,48



95,05



ĐB1.23



24,12



0,37



125,63



23,49



0,44



125,03



ĐB1.24



21,33



0,43



111,11



20,65



0,31



109,92



ĐB1.26



21,75



0,23



113,30



21,67



0,29



115,31



ĐB1.27



20,35



0,24



105,97



19,14



0,47



101,86



ĐB1.28



21,40



0,74



111,46



19,99



0,46



106,37



Mẫu chứng



19,20



0,51



100,00



18,79



0,55



100,00



Nhận xét: Chọn 3 biến chủng số 8, 14, 23 (ĐB1.08, ĐB1.14, ĐB1.23) để nhân

giống, lưu trữ và bảo quản cho các nghiên cứu về sau.

3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2

Tiếp tục đem chủng ĐB1.23 bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách chiếu 60

cm, thời gian 5 phút, tỷ lệ sống sót là 0,23%. Thử HTKS 33 biến chủng sau đột biến bằng

phương pháp khối thạch. Kết quả chính được trình bày ở bảng 3.3.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×