Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ UV, IR, MS.Các thông số này sẽ bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được

Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ UV, IR, MS.Các thông số này sẽ bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được

Tải bản đầy đủ - 0trang

28



Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1.Nâng cao khả năng sinh tổng hợp KS của chủng giống Streptomyces

52.13.

3.1.1.Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên

Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 52.13 trên MT1, thu

được 32 dạng chủng. Đem thử HTKS của các dạng chủng này bằng phương pháp

khối thạch. Kết quả thử HTKS của 12 dạng chủng tốt nhất được trình bày ở bảng

dưới:

Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên

Dạng chủng



Hoạt tính kháng sinh

B.subtilis



P.mirabilis



D (mm)



s (mm)



D (mm)



s (mm)



02



18,38



1,31



18,45



0,19



03



18,79



0,59



18,88



0,83



04



20,42



1,37



19,03



0,35



05



19,1



1,15



18,4



0,53



06



19,64



0,36



19,82



0,85



07



18,69



0,94



18,27



1,31



08



18,73



0,62



18,23



1,51



09



18,23



0,55



19,28



0,47



10



18,54



0,75



18,87



1,57



11



18,99



0,65



19,04



1,09



12



19,17



1,58



18,79



0,34



13



18,93



1,21



18,49



0,64



Nhận xét: Dựa vào bảng ta thấy 3 dạng chủng có hoạt tính tốt nhất là 52.13.4;

52.13.6; 52.13.11. Do đó chúng được giữ lại phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

29



3.1.2.Kết quả đột biến nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của

Streptomyces 52.13

3.1.2.1.Đột biến bằng ánh sáng UV

a) Đột biến lần 1

Chọn biến chủng 52.13.6 để tiến hành đột biến bằng ánh sáng UV. Kết quả

tỉ lệ sống sót sau đột biến là 0,65%. Tiến hành sàng lọc và thử HTKS của các biến

chủng nhằm tìm ra biến chủng có sự biến đổi tăng HTKS mạnh nhất. Kết quả thử

HTKS chính của 10 biến chủng mạnh nhất được thể hiện ở bảng 6 dưới đây:

Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS của các biến chủng sau ĐB 1

Dạng biến



Hoạt tính kháng sinh



chủng



B.subtilis

D (mm)



P.mirabilis



s



% biến đổi



(mm)



HTKS



D (mm)



s



% biến đổi



(mm)



HTKS



ĐB1.02



24,17



0,76



116,48



23,40



0,78



111,38



ĐB1.03



24,47



0,21



117,93



24,87



0,55



118,37



ĐB1.04



23,77



0,45



114,55



23,43



0,38



111,52



ĐB1.08



23,97



1,05



115,52



23,87



1,10



113,61



ĐB1.11



23,50



0,44



113,25



23,83



1,42



113,42



ĐB1.13



23,57



0,44



113,59



23,77



1,50



113,14



ĐB1.14



22,93



0,31



110,51



23,80



0,96



113,28



ĐB1.15



24,23



0,66



116,77



24,13



1,50



114,85



ĐB1.19



22,72



0,95



109,49



24,11



1,72



114,75



ĐB1.20



22,93



0,40



110,51



23,93



1,83



113,90



MC



20,75



1,30



100



21,01



0,34



100,00



Nhận xét:Từ bảng trên cho thấy sau đột biến khả năng sinh tổng hợp KS

của Streptomyces 52.13 đã tăng lên. Trong đó 3 biến chủng có % biến đổi hoạt tính



30



tăng lên nhất là các biến chủng ĐB1 số 03, 08 và 15. Các biến chủng này được giữ

lại cho các thí nghiệm tiếp theo.

b) Đột biến lần 2:

Chọn biến chủng số 03 của ĐB UV lần 1 là biến chủng cho kết quả tốt nhất

để tiến hành đột biến cải tạo giống bằng ánh sáng UV lần 2. Kết quả thu được: độ

sống sót là 0,59%.

Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên sau ĐB và thử HTKS các biến chủng để

chọn biến chủng có HTKS tăng nhiều nhất. Bảng 7 dưới đây là kết quả của 10 biến

chủng tốt nhất

Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS của các biến chủng sau ĐB2

Dạng biến



Hoạt tính kháng sinh



chủng



B.subtilis

D (mm)



P.mirabilis



s



% biến đổi



(mm)



HTKS



D (mm)



s



% biến đổi



(mm)



HTKS



ĐB2.01



25,49



1,2



114,05



25,57



0,31



111,66



ĐB2.02



24,44



1,37



109,35



24,59



1,27



107,38



ĐB2.03



25,38



1,37



113,56



25,85



0,75



112,88



ĐB2.04



24,21



1,22



108,32



24,94



1,16



108,91



ĐB2.05



24,93



1,14



111,54



24,67



0,58



107,73



ĐB2.15



24,47



1,07



109,49



25,14



0,81



109,78



ĐB2.19



23,95



1,61



107,16



24,79



1,07



108,25



ĐB2.21



24,90



1,80



111,41



24,35



1,00



106,33



ĐB2.25



25,27



1,04



113,06



25,67



0,15



112.10



ĐB2.26



25,20



0,26



112,75



25,10



0,30



109,61



MC



22,35



0,21



100,00



22,90



1,05



100,00



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

31



Nhận xét:Từ bảng trên cho thấy sau ĐB 2 thì HTKS tăng khá mạnh so với mẫu

chứng. Giữ lại 3 biến chủng có HTKS tốt nhất để dung cho các thí nghiệm sau. Đó

là 3 biến chủng ĐB2 có số thứ tự số 01, 03 và 25.

3.1.2.2.Đột biến bằng hóa chất:

Chọn biến chủng số 03 của đột biến 2 để tiến hành đột biến hóa học. Kết

quả thu được : độ sống sót là 0,29%. Tiến hành sàng lọc sau đột biến để chọn ra

các biến chủng có % biến đổi hoạt tính dương cao nhất.

Kết quả thử HTKS của một số biến chủng tốt nhất thể hiện ở bảng dưới:

Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS của các biến chủng sau ĐBHH

Dạng biến



Hoạt tính kháng sinh



chủng



B.subtilis

D (mm)



P.mirabilis



s



% biến đổi



(mm)



HTKS



D (mm)



s



% biến đổi



(mm)



HTKS



ĐBHH 02



26,09



1,29



103,82



29,00



1,31



110,22



ĐBHH 03



26,71



0,83



106,29



27,60



1,61



104,90



ĐBHH 04



28,20



1,84



112,22



28,51



0,69



108,36



ĐBHH 11



25,57



0,90



101,75



28,17



1,32



107,07



ĐBHH 12



26,00



0,85



103,46



29,04



0,95



110,38



ĐBHH 13



25,77



1,01



102,55



29,53



0,98



112,24



ĐBHH 17



26,23



1,92



104,38



26,65



0,64



101,29



ĐBHH 21



27,84



0,77



110,78



27,47



1,96



104,41



ĐBHH 22



27,87



1,46



110,90



27,13



1,20



103,12



ĐBHH 24



28,73



1,03



114,33



27,73



0,42



105,40



ĐBHH 25



26,84



1,90



106,80



28,23



0,77



107,30



ĐBHH 27



26,67



0,78



106,13



27,91



1,20



106,08



MC



25,13



0,24



100,00



26,31



1,02



100,00



32



Nhận xét:Từ bảng trên cho thấy sau ĐB HH thì HTKS tăng khá mạnh so với mẫu

chứng. Giữ lại 3 biến chủng có HTKS tốt nhất để dùng cho các thí nghiệm sau. Đó

là 3 biến chủng có số thứ tự số 04, 24 và 25.



3.2.Kết quả chọn dung môi hữu cơ và pH chiết KS từ dịch lọc

Dịch lọc được chiết bằng các dung môi butylacetat, n-butanol, ethylacetat

lần lượt ở các pH=3, 5, 7, 9, 11. Sau khi chiết đem đi thử HTKS pha DMHC và

pha nước. Kết quả được thể hiện ở bảng 9 dưới đây:

Bảng 3.5: Kết quả chọn dung môi hữu cơ và pH từ dịch lọc



Dung môi



butylacetat



n-butanol



ethylacetat



pH

3

5

7

9

11

3

5

7

9

11

3

5

7

9

11



B.subtilis

Pha dung môi

Pha nước

D



(mm)

13,18

11,83

10,28

9,79

9,15

21,37

20,59

20,05

18,16

16,84

22,39

20,78

19,18

17,48

16,27



s

0,12

0,36

0,23

0,45

0,72

0,35

0,43

0,14

0,47

0,21

0.92

1,27

0,42

1,14

0,39



D



(mm)

8,43

7,89

7,87

7,38

8,45

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00



s

0,25

1,52

0,80

0,45

0,96

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00



P.mirabilis

Pha dung mơi

Pha nước

D



(mm)

11,21

10,34

10,40

9,80

9,60

17,42

16,19

17,59

15,52

15,64

21,70

19,33

18,52

15,69

14,62



s

0,62

0,57

0,26

0,60

0,46

0,59

0,09

0,75

1,10

0,94

0,27

0,41

0,14

0,44

0,34



D



(mm)

7,33

7,12

7,03

6,24

6,40

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00



s

0,58

0,40

0,21

0,36

0,31

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00



Nhận xét:Từ bảng trên có thể thấy chiết bằng 2 dung mơi n-butanol và ethylacetat

đều có thể lấy hết KS sang pha DMHC. Tuy nhiên chiết bằng dung môi ethylacetat

thấy ít bị nhũ hóa hơn. Đồng thời tại pH=3 dung mơi ethylacetat chiết được hồn



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

33



toàn KS và cho kết quả thử HTKS cao nhất. Vì vậy chọn chiết KS ở pH=3 với

dung mơi ethylacetat.



3.3. Lên men dịch thể sinh tổng hợp kháng sinh

3.3.1. Chọn môi trường lên men tốt nhất

Tiến hành thử nghiệm khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces

52.13 trên MT1dt, MT2dt, MT5dt trên máy lắc. Chủng giống được sử dụng là

SLNN số 04. Sau quá trình lên men dịch lên men được lọc loại bỏ sinh khối và

đem đi thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp giếng thạch.Kết quả được trình

bày trong bảng 10 dưới đây:

Bảng 3.6: Kết quả chọn MT lên men

VK



P.mirabilis



B.subtilis



MT



D (mm)



s (mm)



D (mm)



s (mm)



MT1dt



21,61



0,58



20,18



0,27



MT2dt



19,06



0,63



18,11



0,68



MT5dt



15.33



0,44



14,79



0,46



Nhận xét:Lên men chủng Streptomyces 52.13 trong MT1dt có hoạt tính kháng

sinh mạnh nhất. Vì vậy MT1dt được chọn làm MT lên men cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.3.2.Chọn biến chủng lên men tốt nhất:

Tiến hành lên men trong MT1dt với các biến chủng Streptomyces 52.13 đã

được lựa chọn giữ lại qua các bước cải tạo giống. Dịch lên men thu được đem lọc

loại bỏ sinh khối rồi tiến hành thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng

thạch.

Kết quả thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men của các biến chủng

Streptomyces 52.13 được trình bày trong bảng 11 dưới đây:



34



Bảng 3.7: Kết quả chọn biến chủng lên men tốt nhất

Biến chủng



P.mirabilis



B.subtilis



D (mm)



s (mm)



D (mm)



s (mm)



SLNN (04)



21,47



0,83



21,59



1,46



SLNN (06)



20,11



1,92



17,80



0,80



SLNN (11)



20,96



0,26



20,01



0,30



ĐB1 (03)



22,99



0,66



21,11



0,27



ĐB 1 (08)



19,18



0,36



17,62



1,28



ĐB 1 (15)



22,93



1,15



21,95



1,19



ĐB 2 (01)



23,59



0,99



22,85



0,31



ĐB 2 (03)



23,80



1,06



21,43



0,61



ĐB 2 (25)



19,12



1,01



18,88



0,19



ĐBHH (04)



24,35



0,49



23,71



0,27



ĐBHH (24)



24,67



1,18



22,24



1,11



ĐBHH (25)



25,62



0,52



24,84



0,32



Nhận xét: Biến chủng số 25 sau đột biến hóa học lên men trên MT1dt cho HTKS

mạnh nhất. Vì vậy, biến chủng này được giữ lại cho các nghiên cứu tiếp theo



3.4.Chiết xuất và bước đầu tinh chế chất kháng sinh từ dịch lên men

3.4.1.Kết quả sắc ký lớp mỏng

Dịch lọc thu được 5 lít, đem chiết với dung mơi ethylacetat pH=3 được 750 ml

dịch chiết. Đem dịch chiết đi cất quay chân không thu được 1.0119g bột KS thô.

Tiến hành sắc ký lớp mỏng dịch chiết ethyl acetat với 4 hệ dung môi sau để sơ

bộ xác định thành phần KS và làm cơ sở cho quá trình tinh chế sau này.

Hệ 1: cloroform : methanol : NH4OH 25% (2:2:1)

Hệ 2: n-butanol: ethanol: dimethylformanid (3:1:1)



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

35



Hệ 3: butylacetat : aceton : triethylamin (1:2:1)

Hệ 4: propanol: ethylacetat : acetonitril (2:3:0,2)

Kết quả được trình bày trong bảng 12 dưới đây

Bảng 3.8: Kết quả sắc ký lớp mỏng với 4 hệ dung môi

Hệ dung môi



Số vết



Rf



Hệ 1



1



0.87



Hệ 2



1



0.75



Hê. 3



1 vết dài hình ngọn đuốc



Hệ 4



1



0.65

0.82



Các bản mỏng sau khi tiến hành sắc ký được đem đi thử hiện hình VSV

(P.mirabilis) cho kết quả: cả 4 bản mỏng đều xuất hiện vòng vơ khuẩn, riêng bản

mỏng của hệ 3 có vòng vơ khuẩn kéo đi dài.

Nhận xét : Cả 4 hệ dung môi chạy sắc ký đều cho kết quả có vết kháng sinh. Hệ 3

có khả năng tách tốt nhất trong 4 hệ trên. Đây là cơ sở cho việc chọn dung môi tiến

hành sắc ký cột.

3.4.2.Kết quả tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột

a) Chạy cột lần 1

Lấy m = 0.1029g bột KS thô đem đi chạy sắc ký cột với hệ dung môi 3 là

butylacetat : aceton : triethylamin tỉ lệ 1:2:1 thu được 20 phân đoạn. Thử hoạt tính

kháng sinh các phân đoạn thu được bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả

được trình bày ở bảng 13 dưới đây:



36



Bảng 3.9: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau sắc kí cột lần 1

Phân đoạn



P.mirabilis



B.subtilis



D (mm)



s (mm)



D (mm)



s (mm)



1



11,35



0,21



11,22



0,17



2



22,60



0,28



21,00



0,71



3



23,10



0,14



21,85



0,64



4



24,35



0,35



22,50



0,28



5



22,32



0,45



19,69



1,40



6



21.47



0,38



19,60



0,28



7



21,14



0,20



19,20



0,00



8



18,30



0,28



16,85



0,64



9



18,20



0,28



16,45



0,07



10



17,67



0,38



16,20



0,11



11



15,25



0,35



14,26



0,06



12



13,16



0.23



13,45



0,07



13



10,38



0.37



9,73



0,07



14



8,50



0.37



8,05



0,04



15



6,13



0,04



5,93



0,10



16-20



0,00



0,00



0,00



0,00



Nhận xét:Các phân đoạn từ 2-10 có hoạt tính tương đối cao, phân đoạn 4 có

nồng độ đậm đặc nhất.

Tiến hành sắc kí lớp mỏng các phân đoạn từ 2-10 bằng hệ dung môi

ethylacetat : n-hexan : methanol (12:5:1). Hiện hình bằng B.subtilis kết quả như

sau:



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

37



Bảng 3.10: Kết quả SKLM các phân đoạn sau sắc kí cột lần 1

Các phân đoạn



Rf quan sát bằng mắt thường



Rf hiện hình VSV



Vết 1



Vết 2



Vết 1



Vết 2



2



0,63



0,43



0,63



0,43



3



0,64



0,45



0,64



0,45



4



0,63



0,43



0,63



0,43



5



0,63



0,44



0,63



0,44



6



0.63



0.42



0,63



0,42



7



0,62



0,41



0,62



0,41



8



0,60



0,39



0,60



0,39



9



0,61



0,39



0,61



0,39



10



0,61



0,37



0,61



0,37



Nhận xét:

Các phân đoạn đều cho bản sắc kí có 2 vết. Từ đó sơ bộ nhận thấy có ít nhất

2 thành phần kháng sinh còn lại trong các phân đoạn trong đó vết đi trước đậm hơn

là KS chính, vết đi sau nhạt hơn là KS phụ. Hệ dung môi 3 đã hết khả năng tách

tiếp, hệ dung mơi mới ethylacetat : n-hexan : methanol (12:5:1) có khả năng tách

tốt. Do vậy chọn hệ dung môi này để chạy sắc kí tiếp nhằm thu được KS tinh khiết.

Dựa vào kết quả thử hoạt tính kháng sinh và chạy sắc kí bản mỏng có thể

thấy các phân đoạn từ 2-7 có HTKS mạnh và kết quả Rf tương tự nhau. Do vậy gộp

các phân đoạn từ 2-7 là phân đoạn chính lại, đem cơ thu được 0,0529g bột kháng

sinh màu đỏ cam. Hiệu suất tinh chế KS lần 1 là 51,41%.

b) Chạy cột lần 2:



38



Cân 0,0529g bột kháng sinh thu được sau tinh chế lần 1, chạy cột với hệ

DM ethylacetat:n-hexan:methanol (12:5:1) thu được 32 phân đoạn. Thử HTKS

các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc thu được kết quả ở bảng 3.11

Bảng 3.11: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau SK cột lần 1

Phân đoạn



P.mirabilis



B.subtilis



D (mm)



s (mm)



D (mm)



s (mm)



1



9,22



0,78



8,93



0,25



2



13,63



0,17



10,47



0,40



3



19,47



0,55



17,83



0,45



4



23,47



0,58



21,14



1,07



5



26,91



0,64



23,28



0,67



6



27,99



0,31



25,53



0,40



7



28,74



0,36



25,80



0,79



8



26,69



0,29



22,17



0,40



9



25,71



0,50



21,75



0,58



10



24,85



0,53



20,60



0,46



11



24,57



0,26



24,45



0,55



12



24,86



0,33



21,77



1,15



13



25,19



0,77



22,45



0,55



14



23,32



0,40



21,01



1,06



15



23,05



1,01



20,15



0,07



16



22,73



1,51



19,85



0,17



17



21,49



0,91



18,76



1,06



18



20,79



0,57



18,57



0,71



19



18,73



0,39



17,91



1,01



20



17,61



1,42



15,53



0,52



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ UV, IR, MS.Các thông số này sẽ bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×